抗寒性不同的枳和宮本柑桔苗生長期致死低溫的探討

摘 要：用本試驗設計改裝的控溫冰箱對2年生的枳(Poncirus trifoliata Raf．)和宮本／枳砧(Citrus reticulataBlanco cv．miyamoto)營養袋盆栽苗進行低溫處理，探討枳和宮本生長期的致死低溫。結果表明，棉絮包蔸保持土溫的效果與低溫處理時間呈極顯著正相關。相關系數為r=0．9624。枳和宮本致死低溫處理分別為-6℃60min和-6℃40 min左右，即該處理導致枳和宮本春葉凍死，電解質滲出率陡然成倍增加，丙二醛含量出現最大值，枳葉片中丙二醛含量比對照增加了14．81％，宮本葉片中丙二醛含量較對照增加17．58％。枳葉片中丙二醛含量從對照到各處理平均是宮本的2．1倍。

關鍵詞：柑桔；低溫脅迫：致死溫度；電導率；丙二醛

中圖分類號：S666

文獻標識碼：A

文章編號：1007—7847(2006)01—0082—05

柑桔是原產我國的一種亞熱帶果樹，已成為南方農村經濟的支柱產業之一。然而，周期性的凍害常給柑桔生產帶來嚴重的損失，抗寒防凍是柑桔生產和科研急待解決的課題。枳是柑桔的主要砧木，冬季落葉，越冬時可抗—20℃左右低溫，是栽培柑桔中最抗寒的種類；宮本是推廣的特早熟溫州蜜柑品種，冬季不落葉，越冬時能耐—8℃左右低溫。是枳本身抗寒性強還是因其冬季落葉而抗寒，或兩種因素綜合才是枳抗寒的真正原因，值得深入探討。目前研究柑桔抗寒能力主要是測定經系列低溫處理材料的電解質滲出率，用Logistic方程的拐點作為被測試材的低溫半致死溫度，系列低溫處理則多為鹽浴等方式處理離體葉片或原生質體，這種離體材料對低溫脅迫的反應與整株植株存在較大差異，因植株遭受低溫脅迫時，根、莖、葉等器官之間發生物質的運轉和信號的轉導。本試驗以生長期的枳和宮奉盆栽苗為試材，通過低溫處理后葉片的受凍表現，配合電解質滲出率和膜脂過氧化產物丙二醛含量的測定，探討兩種材料在生長期的致死低溫，比較其抗寒性，為柑桔抗寒基因的篩選、克隆和抗寒防凍措施的制定提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

選擇苗木主干基部直徑(0．524±0，047)(cm和(0．505±0．022)cm的枳(Pon．cirustrifoliata Raf)和宮本(Citrusreticulata Blancocv．mivamoto)(砧木為枳)2年生苗(12emxl2cm規格的營養袋栽植)作試材，于試驗前移人空調室內，空調溫度設定為20℃，室內溫度為18．5—26．5℃。

1．2 低溫處理

試材在空調室生長2周以后，每次3株用棉絮包裹營養袋及根頸，用本試驗改裝的控溫冰箱進行低溫處理，溫度變化控制在設定值的±0，2℃。以成熟葉片是否凍死(處理后葉片卷曲、干枯)配合電解質滲出率的測定，找到枳和宮本在生長期能耐受的最低溫度。

1．3 葉片電導率和丙二醛含量的測定

對照和低溫處理后的植株從基部往上每測試項目取相同葉位的葉片，自來水洗凈，蒸餾水沖洗，去離子水沖洗，濾紙吸干后剪碎、混勻，準確稱取(0，5±0．002)g測定分析枳和宮本在低溫脅迫及凍死前后葉片電，解質滲出率和丙二醛含量變化，外滲電導率的測定參考張志良的方法，丙二醛含量參考劉祖祺等的方法。

2 結果與分析

2．1 盆栽苗棉絮包蔸對根際土壤溫度的影響

自然條件下，柑桔越冬時氣溫雖然低，但根際土壤的溫度較高，因此根系不耐低溫，本實驗發現，對柑桔苗進行低溫處理時，由于營養袋較小，每袋的土壤量較少，處理后土溫低，而且低溫處理時間稍長，袋中土壤溫度降幅大(表1)。

空調室內氣溫19．6℃時，營養袋里的土溫為17．6℃營養袋經—6℃處理20min后，土溫降低了7．1 ℃，處理80min后，土溫僅2．5℃，降幅達15．1℃．土溫這么低，降幅如此大，對于生長季節的柑桔根系可能造成嚴重傷害。針對這種情況，用剪成約50emx50cm大小的舊棉絮把營養袋及小苗根頸部位包裹起來，再用棉線捆牢。經過這樣包裹的小苗在低溫處理后土溫降幅大大減小，－6℃處理20min后，土溫降低1．1℃，處理80min后，土溫為12℃，降幅5．6℃，而且隨著低溫處理時間延長，保溫的效果越明顯，－6℃處理20min時比不包蔸的土溫高6℃，處理80min后高出了9．5℃。棉絮包蔸與不包蔸，兩者的土壤溫度與低溫處理時間均呈極顯著的負相關，相關系數分別為r=0．958 7和r=0．989 2，同時，棉絮包蔸提高土壤溫度的效果與低溫處理時間呈極顯著正相關，相關系數為r=0．9624，即棉絮包蔸明顯地減緩了降溫的速度。

以空調室材料為對照，研究了低溫處理對根系的影響。棉絮包蔸－6℃20min處理，地上部葉片未受凍；棉絮包蔸－6℃40min處理，地上部葉片凍死，兩者的根系與對照表現一致，顏色較淺有生活力。而不用棉絮包蔸－6℃ 80min處理，地上部葉片凍死，根系變褐色、干縮，無生活力。

綜上所述，對盆栽苗進行零下低溫處理時，用棉絮包蔸可有效地保持根際土壤溫度，避免根系受凍，與田間柑桔越冬時氣溫低土溫高的自然狀況比較接近，使抗寒研究更符合實際情況。

2.2 枳和宮本致死低溫的測定

為了探討枳和宮本生長期所能耐受的致死低溫，兩種材料的盆栽苗用棉絮包蔸，用不同低溫處理30min，觀察春葉受凍情況，處理剛結束材料從冰箱回到空調室，受凍的葉片為水漬狀、透明，顏色加深變成墨綠色，質感變薄，葉片上的細小白點消失，數小時后逐漸卷曲，2—3 d干枯。枳—2～－6℃處理30min均未表現凍害癥狀，－8～－16℃處理30rain全部葉片均出現凍害癥狀；宮本—2℃和—4℃處理30rain葉片未受凍，－6℃處理30rain少量葉片出現凍害，－8～－16℃處理30min全部葉片受凍(表2)。

進一步對兩種材料進行－7℃ 30min處理，結果兩種材料的葉片全部受凍。鑒于上述結果，對兩種試材進行—6℃不同時間的處理(表3)，發現枳—6℃處理10—30min時葉片未受凍，處理40min及50min則多數葉片出現凍害；宮本—6℃處理10-20rain無凍害，處理30min少量葉片受凍，處理40-50min全都葉斤受凍。因而，根據葉片受凍的形態表現，枳和宮本生長期耐受低溫的臨界致死處理分別為—6t 50min和—6℃40 rain。

2.3 葉片電導率的變化與致死低溫的關系

枳在—6℃處理50min及其以前，葉片電解質滲出率低的在10％以下，高的為25.05％，但—6℃處理60、70、80rain時葉片電解質滲出率陡然增加，分別為63．18％、73．26％和55．32％，分別成倍增加。宮本也存在類似的變化趨勢，—6℃處理20、30min時，葉片電解質滲出率僅6．56％、11．90％，—6℃處理40—80rain，電解質滲出率急劇上升，其處理40、50、60、70、80min時的電解質滲出率分別達58，64％、64，74％、74．29％、78．68％、58．64％(圖1)。

從圖1看出，隨著低溫處理時間的延長，葉片電解質滲出率呈S型變化，葉片未受凍處理階段，低溫脅迫雖導致電解質滲出率比對照增加廠，但均在25％以下，當葉片表現凍害癥狀以后其電解質滲出率陡然成倍增加，均在50％以上。

2．4 葉片中丙二醛含量變化與致死低溫的關系

—6℃處理的枳和宮本幼苗葉片中丙二醛含量(圖2)比對照略有減少，枳在—6℃處理60rain，宮本在—6℃處理40min出現峰值，隨后減少并隨低溫處理時間的延長而穩定在較低的水平。枳－6℃處理20～50min時葉片中丙二醛含量比對照平均減少13.23％，處理60 rain時較對照增加了14，81％，達到最大值，處理70-80min時比對照平均減少19．05％，宮本—6℃處理20—30 min時，丙二醛含量比對照平均減少了20．88％，處理40rain時比對照增加了17．58％，達到最大值，處理50-80min，又比對照平均減少了10．99％，而且枳的丙二醛含量從對照到各處理時期均明顯高于宮本，平均是宮本的2．1倍。

3 討論

人工模擬低溫處理時根系受凍將直接影響低溫脅迫處理結果的準確性，因為柑桔越冬時根系分布土層(20-40em)的土壤溫度高于氣溫，長沙市馬坡嶺地面觀測站2004年12月31日的觀測資料表明，地表溫度為—6．1℃時，20cm土層的土溫為6．4℃，因而柑桔根系的耐寒能力比地上部枝、葉弱，本試驗用棉絮把營養袋及小苗根頸部位包裹起來，—6℃低溫處理80rain后營養袋中土壤溫度保持在12℃以上，使低溫脅迫處理較好地符合實際情況。

電解滲出率反映了細胞膜受損傷的狀況，其值較小則細胞膜損傷較輕，能夠恢復；其值較大時；膜損傷嚴重，電解質大量外滲，細胞的損傷不可逆轉，導致細胞死亡，葉片表現凍害。低溫脅迫導致丙二醛含量增加，丙二醛含量高說明膜脂受傷害嚴重。本研究中枳和宮本在生長期短期驟冷處理，葉片電解質滲出率及丙二醛含量的變化趨勢相似，分別在—6℃60min和—6℃40min處理發生急劇變化，均與葉片是否凍害的形態表現相吻合。因此，枳和宮本2年生苗生長期致死低溫為-6℃ 60rain處理和—6℃40min處理，也說明枳越冬時抗寒能力強的原因不僅僅是冬季落葉，其生長期的抗寒性比宮本強，表明枳本身具有比宮本抗寒的基因類型。因而，在柑桔植物中篩選抗寒基因進行抗寒轉基因研究時，枳應是很好的抗寒基因資源。

有研究指出低溫脅迫導致丙二醛的積累，柑桔的抗寒性與丙二醛含量呈負相關。在本試驗中丙二醛含量不是隨著低溫處理時間的延長而發生積累，且枳葉片的丙二醛含量從對照到各低溫處理均高于宮本，平均是宮本的2．1倍，與兩種材料的抗寒性強弱成反比，其原因可能是整株試材與離體試材對低溫脅迫的響應機制不同所致，或者丙二醛含量與不同材料的抗寒力強弱無關，只與材料受低溫脅迫時細胞膜的過氧化有關，枳葉片細胞膜耐受自由基破壞的能力可能強于宮本，這種推測有待于進一步的研究來證實。