一種高效而經(jīng)濟獲得長片段基因突變體的方法

摘 要：重組PCR方法的發(fā)展為體外突變技術(shù)提供了更快捷、準(zhǔn)確的方法。通過改進(jìn)引物設(shè)計和PCR保真性等方法，應(yīng)用重疊延伸PCR的原理成功地實現(xiàn)了對BA基因的定點突變，并構(gòu)建了其含有m1，m2，m3和m4的突變體。實驗證明通過這種改進(jìn)方法可以有效地進(jìn)行長片段基因的突變，并且這種方法與其他方法相比具有簡便、快捷、經(jīng)濟、高效的特點。

關(guān)鍵詞：定點突變；重疊延伸PCR(OE PCR)；基因

中圖分類號：Q785

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007—7847(2006)01—0034—05

體外定點突變技術(shù)是研究基因、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是實驗室中改造或優(yōu)化基因常用的手段。缺失、插入或替換特定堿基的定點突變可用不同的方法來實現(xiàn)。目前已報道的以PCR為基礎(chǔ)的各種誘變方法中，“重疊延伸法”和“大引物法”比較突出，在此基礎(chǔ)上發(fā)展的“一步PCR方法”也有一定的應(yīng)用范圍。這些方法雖然都有各自的優(yōu)點，但其誘變率卻不理想。

本研究中突變的基因(BA)長度較大(3，0kb)，我們擬將它的4個絲氨酸(Ser)位點(m1，m2，m3和m4)通過堿基置換變?yōu)榫幋a丙氨酸(AIa)的位點，預(yù)突變的位置都位于基因中后段，綜合這些特點，本研究通過改進(jìn)引物設(shè)計和PCR保真性等方法應(yīng)用重疊延伸PCR(overlap exten-sionPCR，OEPCR)原理實現(xiàn)了對BA基因的定點突變并構(gòu)建了突變體。實驗證明了此種改良方法簡便、快捷、經(jīng)濟而又突變準(zhǔn)確，尤其適用于長片段基因的定點突變。

1 材料和方法

1．1 材料

T4DNA連接酶購自NEB公司，T4DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶KpnI、XhoI與dNTPs及凝膠純化回收試劑盒(DV805A)均購自TaKaRa公司，引物合成于TaKaRa公司，PfuUltra^TMDNA高保真聚合酶購自Stratagene公司，pOTB7-BA質(zhì)粒，克隆載體pcDNA3，1 HisA購自lnvitrogen公司。

1．2 方法

自行設(shè)計的在BA基因開放閱讀框兩端的引物Pa／Pb，通過分別引入限制性酶切位點KPnI和Xho I可將其導(dǎo)人載體pcDNA 3．1 HisA．引物如下：

OEPCR分為三輪，第一輪以質(zhì)粒pOTB7—BA為模板利用引物Pa即BA基因開放閱讀框外側(cè)5，上游引物與突變點3’下游引物PmR(mutationreverseprimer)(PmlR，Pm2R，Pm3R或Pm4R)，第二輪仍以質(zhì)粒pOTB7-BA為模板利用引物Pb即BA基因開放閱讀框外側(cè)3’下游引物與突變點5’上游引物PmF(mutation forward primer)(PmlF，Pm2F，Pm3F或Pm4F)。第一、二輪的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后以摩爾比1：1為模板利用引物Pa／Pb進(jìn)行第三輪的重疊延伸PCR，變性后的PaPmR和PbPmF段在重疊區(qū)域退火，進(jìn)行延伸形成全長的突變雙鏈DNA。因第一、二輪的PCR產(chǎn)物在擬突變點左右有重疊，故此稱為重疊延伸PCR(見圖1)。

突變引物PmlF／PmlR，Pm2F／Pm2R，Pm3F／Pm3R，Pm4F／Pm4R分別設(shè)計在這4個擬突變位點的兩側(cè)，并且每對引物之間有一定的重疊堿基，重疊的堿基數(shù)都在2t bp以上(見表1)。

PCR反應(yīng)體系如下：在每個PCR體系中，模板20ng，dNTPs0．2mmol／L，鎂離子1．5mmol／L，每種引物10μmol／L，PfuUltraTMDNA高保真聚合酶0．025 U，對于所有的PCR反應(yīng)，均是94℃預(yù)變性3 min，執(zhí)行下述30個循環(huán)之后，72℃延伸10rain，4℃保存。PCR反應(yīng)條件見表2，

直接用引物Pa與Pb擴增出BA野生型(BAwildtype，BAwt)轉(zhuǎn)入載體作為試驗的對照。BAwt和4個不同突變體的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳、純化回收及雙酶切(kpI和XhoI)與雙酶切載體pcDNA3．1 HisA(KpnI和Xh01)連接，4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化人大腸桿菌DH5a。采用含氨芐青霉素(50mg／L)的LB平板篩選白斑，酶切鑒定篩選陽性克隆。

1.3 測序

核苷酸序列的測定采用Sanger雙脫氧末端中止法，在ABl373ADNA序列測定儀上測序，此項工作由上海生工測序部完成。

2 結(jié)果

對于這4個突變體，每一輪PCR擴增出的產(chǎn)物都可見清晰的特異性條帶，片段大小都與預(yù)期的理論值相符(圖2、3、4)

對于重組質(zhì)粒BA－pcDNA 3．1 His A進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果都與預(yù)期的理論值相符，表明上、下游片段連接正確。

測序分析對突變點進(jìn)行了準(zhǔn)確地分析，并與引物pa與Pb擴增出的BA野生型的測序結(jié)果作比較，結(jié)果表明，這4種不同的突變體ml，m2，m3和m4的Ser位點被準(zhǔn)確的突變?yōu)锳la(圖5、6、7、8)，并且無其他的突變發(fā)生．提交的克隆經(jīng)測序被100％的證實進(jìn)行了準(zhǔn)確的預(yù)定突變。

3 討論

綜上所述，我們采用此方法對BA長片段基因進(jìn)行定點突變，其結(jié)果表明此方法具有準(zhǔn)確的誘變率，實用性強，使用的試劑少、費用低等特點．由于BA基因的片段長度較大(3．0kb)，而且擬突變的位點位于基因5’方向2／3處，離5’端2kb或者3，端1 kb，距離都較遠(yuǎn)，這就決定了在對該基因進(jìn)行突變過程中應(yīng)該注意如下幾個問題：

1)確保預(yù)定突變的誘變成功率；2)保證長片段基因除突變位點以外部分的擴增準(zhǔn)確性；3)避免作為PCR模板的野生型質(zhì)粒帶人的微量污染而導(dǎo)致的陰性結(jié)果。

因此在本實驗中我們采取了如下措施以避免上述問題。首先，在引物的設(shè)計方面，通常在擬突變位點的兩側(cè)設(shè)計的一對引物之間有一定的重疊堿基，大概在15bp左右，引物的長度在15～18bp左右。我們在設(shè)計引物的時候考慮到長片段基因的特點將突變引物的長度設(shè)計在22 bp左右，提高了引物與模板結(jié)合的特異性。另外每對突變引物的重疊堿基均在21 bp以上，保證了上、下游(PaPmR和PbPmF)(見圖1)片段的雙重突變重疊區(qū)域的長度，提高了突變的成功率。本研究曾采用長度18bp，重疊堿基15 bp的一對引物，結(jié)果經(jīng)測序鑒定沒有實現(xiàn)定點突變，其次，在突變點誘變成功基礎(chǔ)上，保持這樣長片段基因除突變堿基以外其它部分的準(zhǔn)確才可為后續(xù)試驗奠定可靠的基礎(chǔ)，所以我們采用了高可信度的PfuUltraDNAPolymerase，PfuUltr^TM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為普通PfuDNA聚合酶的三分之一，為TaqDNA聚合酶的十八分之一。它是目前保真度最高的PCR酶。該酶添加ArchaeMaxx聚合酶增強因子，顯著提高產(chǎn)量、減少擴增時間并可擴增更長的模板，確保了擴增準(zhǔn)確性，另外，我們在前兩輪的PCR結(jié)束后都對擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，切膠純化回收作為下一輪擴增的模板，避免了作為PCR模板的野生型質(zhì)粒帶入的污染或者是模板質(zhì)粒純化時所帶的細(xì)菌染色體DNA污染。

在本實驗中，我們利用上述改良步驟獲得了正確的突變體克隆，目前國內(nèi)報道的利用重疊延伸法進(jìn)行突變的最大的基因為2．4kb，我們得到了3．0kb的定點突變基因，突變點位于片段2／3處，證實大片段基因的改造完全可以利用這種方法實現(xiàn)；而且這個方法所進(jìn)行的三輪PCR在1—2d內(nèi)就可以完成，既快捷又準(zhǔn)確。

對于長片段基因的體外定點突變，本試驗提供了一種簡便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟而又切實可行的方法。