人－山羊異種核移植胚胎發育的初步研究

摘 要：以體外分離培養的人胚胎成纖維細胞為核供體，經血清饑餓培養后，通過顯微操作技術移入山羊去核卵母細胞中，采用化學方法激活重組胚。通過體外培養觀察，2-細胞胚胎發育率可達51．33％，4-細胞發育率為31．42％，但發育至桑椹胚階段的胚胎數目大大減少，僅為9．73％。雖然目前尚未能獲得異種核移植囊胚，但實驗結果說明山羊成熟卯母細胞可以支持人體細胞核完成重編程， 人-山羊異種體細胞核移植重組胚可在體外完成其早期發育。

關鍵詞：異種核移植；人：山羊；卵母細胞

中圖分類號：Q813；R329

文獻標識碼：A

文章編號：1007—7847(2006)01—0050—05

治療性克隆(Therapeutic ccloning)是指以患者的體細胞作為供核，移入去核的卵母細胞內，將重構胚培育至囊胚，從內細胞團中分離出胚胎干細胞，為患者提供與其自身遺傳物質一致的組織細胞或器官，用于患者疾病的治療。目前，治療性克隆存在的問題主要有：核移植總體效率很低、卵母細胞來源及質量不穩定、供核細胞種類的選擇、操作水平、體外培養條件等。由于人類卵母細胞來源非常有限，且受到法律、倫理等多種因素的限制，很難獲得足夠數量的人卵母細胞用于實驗研究，異種核移植技術的出現為解決這一難題提供了可能，目前已建立了使用兔卵母細胞的異種體細胞核移植胚胎干細胞，但胚胎發育率較低。本研究旨在對山羊成熟卵母細胞能否支持人體細胞核的重編程，并使重組胚獲得一定程度的發育進行初步探索，以便為將來利用動物卵母細胞來獲取治療性克隆所需的胚胎干細胞奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 胚胎組織

胎齡5-9周人工終止妊娠的廢棄胚胎，要求胚體完整，無嚴重污染，廢棄胚胎由解放軍第四軍醫大學唐都醫院婦產科提供．使用前征得患者同意，簽署知情同意書，并獲得學校醫學倫理委員會的批準。

1．1．2 山羊卵巢

采集于陜西省西安市屠宰場．采集的卵巢置于20-30℃含0.32g／L硫酸慶大霉素的生理鹽水中，6~8 h運回實驗室。

1．1.3 主要試劑

DMEM培養液、M199培養液、SOF培養液、胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司；二甲基亞砜(DMSO)、離子霉素(10nomycin)、6－二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、Hoechst33342、細胞松弛素B(CCB)、透明質酸酶、胰蛋白酶、EDTA、聚乙烯吡咯酮(PVP)、礦物油購自Sigma公司；磷酸緩沖液(PBS)自配。

1．1，4 儀器設備

細胞培養箱(Heraus，西德)、實體顯微鏡(Olympus)、顯微操作儀(Nikon)，

1.2 方法

1，2，l 山羊卵母細胞的體外成熟

將卵巢系膜剪去，用溫生理鹽水沖洗后置于含10mg／L肝素的PBS液中，用切剖法采集卵斤卵母細胞復合體(cumlllus-oocyte complexes，COCs)，在實體顯微鏡下檢查回收，將收集的COCs在PBS中清洗3次，再H—M199(M199+10％FBS+10 mg／L FSH+20 mg／LLH)洗1次后置于H—M199中進行體外成熟培養，培養條件為38．5 t、5％CO₂、飽和濕度．

1.2.2 成熟山羊卵母細胞的去核

體外成熟培養18～20 h后，將COCs置于0．2％透明質酸酶中消化，輕輕吹打，使卵母細胞周圍的卵丘細胞脫落，選擇排出第一極體的卵母細胞在H—M199中清洗3次，置于含5 mg／L CCB和10％FBS的PBS微滴中，38．5℃、5％C0₂、飽和濕度孵育10 rain，在顯微操作儀下用持卵針固定卵母細胞，使第一極體在鏡下位于2點至4點鐘的位置，用外徑為20～30μm的去核針吸取第一極體及其周圍1／4--1／3的細胞質進行去核。去核后的卵母細胞用1 mg／L Hoechst33342染色15rain，然后在熒光顯微鏡上檢查去核情況，挑選出完全去核的卵母細胞作為核移植受體，見圖1。

1.2.3 人胚胎成纖維細胞的分離培養

用含青鏈霉素的PBS浸洗胎兒3—5次，實體顯微鏡下去除胚胎頭部、內臟和四肢，將軀干部組織以PBS沖洗充分除去紅細胞后剪碎至I mm3大小，0．25％胰蛋白酶-0．04％EDTA混合消化液室溫下作用3-5 min，加入等量DMEM+10％(v／v)FBS培養液終止消化，800~--t 000r／min離心3-~5 min，棄上清液，加入前述培養液懸浮細胞，調整細胞密度在10⁵～10⁶／mL，置于37℃、5％CO₂、飽和濕度培養箱中培養30min，等部分成纖維細胞首先貼壁后，將培養液與未貼壁細胞一同吸出，加入培養液繼續培養。約2～3 d后，胚胎成纖維細胞約80％鋪滿瓶底，可進行傳代培養，或冷凍保存備用，見圖2。

1．2．4 供體細胞的準備

取第5—7代對數生長期人胚胎成纖維細胞，在DMEM+0，5％(v／v)FBS培養液中血清饑餓培養3～5d。核移植前2h用0．25％胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液，待用。

1．2．5 重組胚的構建

將供體細胞懸于含10％PVP和5mg／LCCB的PBS操作微滴中，在顯微操作儀下用內徑為12～15μm的注射針反復吸吐供體細胞，使其細胞膜破裂成為核胞體，再用注射針將核胞體直接注射到去核卵母細胞的細胞質內。

1．2．6 重組胚的激活及體外培養

將注核后的重組胚在H-M199培養液中培養3—6h后進行激活。用含5μmol／LIonomycin的培養液處理4min，然后在含2 mmol／L 6-DMAP和5mg／LCCB的培養液中作用4h，用培養液洗3次后轉移到SOFaa培養液(SOF+2％必需氨基酸+l％非必需氨基酸+1 mmol／L谷氨酰胺+8g／LBSA)微滴中，與顆粒細胞單層在38．5℃、5％C02、飽和濕度下進行共培養，每48h換液1次。第72h加10％(v／v)FBS繼續培養，每天觀察，記錄胚胎發育情況，見圖3。

2 結果

實驗結果證明，山羊成熟卵母細胞可以支持人體細胞核完成重編程，人-山羊異種體細胞核移植重組胚可在體外完成其早期發育，2-細胞胚胎的發育率可達51．33％，但發育至桑椹胚階段的胚胎數目大大減少，桑椹胚發育率僅為9，73％，且目前尚未能獲得囊胚發育，見表1，

3 討論

目前，核移植胚胎干(nucleartransferredem—bryonicstem，ntES)細胞的建系效率還很低，理論上一個ntES細胞系平均需要666個卵母細胞[5)．如果使用人卵母細胞進行治療性克隆，用于人類疾病的治療，這樣的代價是非常大的。解決這一問題的關鍵是用新的策略獲得卵母細胞。多數研究證實，某些哺乳動物(如牛、羊、兔)的卵母細胞具有接受異種體細胞核的能力，異種體細胞核在這些動物的卵母細胞中可以發生去分化和重編程。由于羊的卵母細胞容易獲得，而且西北農林大學在體細胞克隆羊研究方面積累了豐富的研究經驗和方法，因此，我們首次探索用山羊卵母細胞來支持人體細胞核的發育。

在本實驗中，我們首次將人胚胎成纖維細胞核移入山羊卵母細胞，2-細胞胚胎的發育率可達51．33％，但發育至桑椹胚階段的胚胎數目大大減少，桑椹胚發育率僅為9．73％。低胚胎發育率是哺乳動物異種核移植胚胎發育存在的一個共同問題，由于影響核移植胚胎發育的因素很多，包括供核細胞類型、卵母細胞去核的方法、體外培養條件等，大量的實驗證明，以胚胎干細胞和胎兒成纖維細胞作為核供體比成年體細胞作為核供體所得異種重組胚的發育率要高。我們在進行人—山羊異種重組胚的發育實驗中選用人胚胎成纖維細胞作為供體核，也基于此考慮。

核質相容性是影響異種核移植胚胎發育的另一重要因素。當體細胞核移入去核卵母細胞后，首先在母源性RNA和蛋白質因子的控制下進行去分化和重編程，只有在母源性RNA和蛋白質消耗完之前，細胞核能夠正確啟動某些基因的轉錄，并合成相應的蛋白質和酶，胚胎的發育才能進行下去，否則，發育將停滯。這一過程被稱為“母胚轉換”(maternfil to embryonic transition，MET)。能否正確地進行MET是影響異種重組胚發育的重要因素，而順利進行MET取決于異種核質間的親和性或排斥性。與山羊同種核移植的囊胚發育率(17％—20％)相比較，本研究人—山羊異種重組胚的桑椹胚發育率僅為9．73％，且尚未能獲得異種核移植囊胚，不能排除人—山羊異種間核質存在排斥性。

此外，選擇合適的體外培養體系亦是影響重組胚發育的關鍵因素。本實驗采用的SOFaa培養基為山羊胚胎體外培養的常用培養基，可以支持山羊卵胞質的發育，但可能對人—山羊異種核移植胚胎發育產生不利影響。本實驗中囊胚發育率低與體外培養體系也可能有一定關系。

本研究初步探索選用人胚胎成纖維細胞作為核移植供體細胞，移入去核的山羊成熟卵母細胞構建重組胚，獲得了較高的2—細胞、4—細胞胚胎發育率(51，33％和31，42％)，提示山羊成熟卵母細胞可以支持人體細胞核完成重編程，且重組胚可以在體外完成其早期發育．但桑椹胚發育率較低(9．73％)，且暫時未能獲得異種核移植囊胚，可能與動物異種重組胚的MET、以及培養基、培養溫度的選擇等有關。如何解決這些矛盾，提高重組胚的發育率，將是今后研究的重點。