ｎｍ２３－Ｈ１基因轉(zhuǎn)染Ｌ９９８１肺癌細(xì)胞前后基因表達(dá)譜的變化

摘 要：應(yīng)用基因芯片檢測L9981細(xì)胞轉(zhuǎn)染nm23-H1基因前后細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變。提取L9981細(xì)胞轉(zhuǎn)染nm23-H1基因前后細(xì)胞的總RNA，純化為mRNA后再轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sau3AI消化后，cDNA片段分別用cy3和cy5標(biāo)記， 與定制的包含14000個(gè)基因芯片雜交。雜交結(jié)果經(jīng)掃描和軟件分析，nm23-H1基因轉(zhuǎn)染L9981細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)1156(8．26％，1156/14 000)個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，而642(4．59％，642／14000)個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。涉及基因包括信號(hào)傳導(dǎo)、癌基因與抑癌基因、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、細(xì)胞周期與凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞骨架相關(guān)基因， 以及細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子等。nm23-H1基因是通過對轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的調(diào)節(jié)來發(fā)揮其抑制肺癌細(xì)胞株L9981侵襲和轉(zhuǎn)移作用的。

關(guān)鍵詞：L9981；基因芯片；基因表達(dá)；nm23-H1基因

中圖分類號(hào)：R734．2；Q813．1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007—7847(2006)01—0077—05

nm23-H1基因已被證明是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。將nm23-H1基因的cDNA轉(zhuǎn)入nm23-H1基因表達(dá)缺失的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981，可以逆轉(zhuǎn)其惡性表型。但是nm23-H1抑制肺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不十分清楚，我們以往的研究表明，nm23-H1基因抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移可能是通過對轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，為進(jìn)一步研究nm23-H1作用的分子機(jī)制，我們應(yīng)用基因芯片檢測了nm23-Hl轉(zhuǎn)染L9981前后相關(guān)基因表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1．1 材料

l，1．1 細(xì)胞株

1)L9981(高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株)；2)L9981－nm23-H1(穩(wěn)定表達(dá)nm23-H1基因的L9981細(xì)胞株)。均由四川大學(xué)華西醫(yī)院四川省肺癌分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1．1．2 常用試劑及設(shè)備

精制小牛血清和RPMI t640培養(yǎng)基購自Hy－clone公司；用120mmol／L的NaOH溶液配成lmmol／L的貯備液，4℃貯存。SuperScriptTM IIRNase H- Reverse Transcriptase(1nvitrogenCat．No．18064-014)，dATP、dGTP、dCTP、dTYPOligod(T) Primer(Bioasia合成)，Cy5(Amersham，Cat，No．PA55021)，Cy3(Amersham，Cat．No．PA53021)， RNA inhibito(Takara，Cat．No．D2311A)，OlAquick Nucleotide RemovalKit(OIAGEN，Cat，No．28306)Genemachine：型號(hào)OmniGrid 100Pixsys5500芯片打印僅購自Carte—sian公司，ScanArrayLite芯片掃描儀及其分析軟件Quantarray購自GsiLumonics公司，玻片及芯片雜交盒購自Coming公司。

1．1．3 基因芯片

項(xiàng)目所用芯片版本號(hào)為2．2人cDNA基因表達(dá)譜芯片，產(chǎn)品目錄號(hào)為SBC-R-HC-100-22．芯片編號(hào)為17874，17873(上海生物芯片工程公司)。

1．2 方法

1．2．1 總RNA的純化

(RNeasy Mini Kit)應(yīng)用QIAGEN RNeasyKit純化總RNA，詳細(xì)操作原理和方法見RNeasyMini Protoc01。

1，2，2 總RNA質(zhì)量檢測

(Labonchip檢測)具體操作步驟參考人cD-NA表達(dá)譜芯片使用手冊，SBC-H—HC-100-22，具體結(jié)果見《樣品質(zhì)檢報(bào)告》。Lab-on-chip參照Agi-lent 2100分析儀操作手冊，制備凝膠，按照軟件提示進(jìn)行RNA電泳操作，評價(jià)RNA質(zhì)量。

1．2．3 樣品制備

cDNA用Sau3Al酶切后接上接頭，之后用PCR通用引物擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后取出500 ng。實(shí)驗(yàn)標(biāo)記方法采用cDNA直接標(biāo)記法，其中實(shí)驗(yàn)組RNA(L9981－nm23-H1)采用cy3熒光標(biāo)記，對照組RNA(L9981)RNA采用熒光cy5標(biāo)記。加入Cy3／Cy5標(biāo)記的引物(100 lLm01／L)21lL(NaOH作用的對照組用Cy5標(biāo)記，As20，作用的處理組用Cy3標(biāo)記)，同樣條件再行PCR擴(kuò)增和純化，將PCR產(chǎn)物終濃度調(diào)至200mg／L。

1，2．4 雜交

標(biāo)記后的樣品95℃變性后加到經(jīng)預(yù)雜交的芯片陣列表面，輕輕覆上蓋玻片，放人雜交盒內(nèi)，42℃雜交18h。

1．2．5 檢測與分析

芯片結(jié)果采用Agilent掃描儀進(jìn)行掃描，Ima-gene軟件讀取數(shù)據(jù)Scan resolution 10μm，PMT100％，最后采用Genespring進(jìn)行Normalize處理分析，最后ratio值為cy3／cy5，即實(shí)驗(yàn)組／對照組．差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：(1)ratio>或=2為上調(diào)基因，ratio喊=0．5為下調(diào)基因。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

聚類分析法。應(yīng)用genespring和cluster分析軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)胞的總RNA電泳圖

兩株細(xì)胞(L9981，nm23—H1和L9981)總RNA抽提純化后，1％的瓊脂糖凝膠電泳可以看到明顯的28、18、5S條帶，并且28S的條帶明顯亮于18S帶；70℃水浴保溫1h后的電泳圖與水浴前的電泳圖無明顯差異，證明所提取的總RNA質(zhì)量及完整性均很好(圖1)。

2．2 基因芯片雜交結(jié)果和分析

再將Cy5和Cy3的掃描圖像完全重疊，得到的雜交圖中(圖2)，紅色點(diǎn)表示低表達(dá)，綠色點(diǎn)表示高表達(dá)，黃色點(diǎn)表示表達(dá)水平無改變。圖經(jīng)軟件分析后，得到芯片雜交的散點(diǎn)圖(圖3)。每個(gè)點(diǎn)的Y軸表示Cy3的雜交信號(hào)的相對強(qiáng)度，X軸表示Cy5雜交信號(hào)的相對強(qiáng)度。45°角直線(實(shí)線所示)上的點(diǎn)Cy5／Cy3的比率為l，表示無差異表達(dá)，遠(yuǎn)離45°角直線的點(diǎn)為差異表達(dá)，離的越遠(yuǎn)，表示差異越大，落在2條虛線以外的點(diǎn)即是Cy3／Cy5的比率大于2或小于0．5的點(diǎn)。

2.3 基因芯片篩選結(jié)果

nm23-H1基因轉(zhuǎn)染L9981細(xì)胞前后差異表達(dá)基因共l792條，其中基因表達(dá)增加(上調(diào))為1156條，表達(dá)減少(下調(diào))為642條．在表達(dá)上調(diào)的基因中有未知功能的基因1035條，而功能清楚的基因121條，其中包括：細(xì)胞周期與凋亡基因31條、癌基因0條，抑癌基因18條、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因12條，細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子13條，細(xì)胞信號(hào)與蛋白相關(guān)基因38條，細(xì)胞外基質(zhì)與骨架蛋白9條，在表達(dá)下調(diào)的基因中有541條功能不明的基因，而已知基因有101條，其中包括：細(xì)胞周期與凋亡基因12條、癌基因11條，抑癌基因3條、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因14條，細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子21條，細(xì)胞信號(hào)與蛋白相關(guān)基因27條，細(xì)胞外基質(zhì)與骨架蛋白13條(見表1)。

3 討論

nm23-H1基因是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，它的低表達(dá)和缺失與肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)．我們的前期研究發(fā)現(xiàn)nm23—HI基因蛋白和mBNA低表達(dá)、突變，等位基因缺失與肺癌的高轉(zhuǎn)移性和預(yù)后不良有密切關(guān)系。具有高轉(zhuǎn)移潛能的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌L9981細(xì)胞中存在nm23-HI等位基因的雜合性缺失，L9981細(xì)胞在體外具有較強(qiáng)的克隆形成能力和侵襲力，在裸鼠體內(nèi)的自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移能力為100％。以往的研究表明將nm23-HI基因?qū)隠9981細(xì)胞株可以逆轉(zhuǎn)其惡性表型，表現(xiàn)為體外增殖能力，克隆形成能力，侵襲力，和自發(fā)性裸鼠肺轉(zhuǎn)移能力顯著降低。周清華等的研究發(fā)現(xiàn)伴有nm23-H1基因缺失的肺癌常伴有一些腫瘤侵襲相關(guān)分子的表達(dá)異常，并推測nm23-H1基因可能為“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級聯(lián)”相關(guān)基因的上游調(diào)節(jié)基因，它對腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的抑制作用是通過調(diào)控下游基因?qū)崿F(xiàn)的。但是nm23-HI基因逆轉(zhuǎn)肺癌惡性表型的分子機(jī)制尚不清楚。

利用基因芯片技術(shù)為我們研究nm23-H1基因結(jié)構(gòu)和功能的變化對肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供理想的技術(shù)支持，基因表達(dá)譜芯片具有高通量、大規(guī)模、快速高效和靈敏度高的特點(diǎn)，可以分析兩組或兩組以上不同來源的mRNA豐度的差異，通過計(jì)算雜交信號(hào)的比值和統(tǒng)計(jì)分析，可以獲得差異表達(dá)基因信息。

本實(shí)驗(yàn)利用腫瘤基因表達(dá)譜芯片分析nm23-H1基因轉(zhuǎn)染L9981細(xì)胞前后相關(guān)基因的表達(dá)改變，基因表達(dá)譜芯片的應(yīng)用為研究nm23-H1基因作用的分子機(jī)制提供了相關(guān)基因的基因組學(xué)證據(jù)，突破了以往單個(gè)基因孤立研究的局限，特別是采用將外源基因?qū)氩槐磉_(dá)該基因的細(xì)胞，避免了標(biāo)本取樣的組織學(xué)差異，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)更加可靠，更加便于分析，本研究應(yīng)用包含14 000種基因的SBC-R-HC-100-22cDNA基因表達(dá)譜芯片，對L9981細(xì)胞轉(zhuǎn)染nm23-Hl基因前后進(jìn)行分析，通過比較兩者基因表達(dá)的差異信息，尋找與nm23-H1基因表達(dá)相關(guān)的基因，本研究共篩選出差異表達(dá)基因1792個(gè)，轉(zhuǎn)染nm23-Hl基因后，基因表達(dá)上調(diào)的基因有1156條，其中有1035條基因的功能不清楚，而已知基因有121條；而基因表達(dá)下調(diào)的基因有642條，其中有541條是未知基因，101條是功能清楚的基因．在上調(diào)和下調(diào)的已知基因中包括：細(xì)胞周期與凋亡基因、癌基因，抑癌基因、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因于，細(xì)胞信號(hào)與蛋白相關(guān)基因，細(xì)胞外基質(zhì)與骨架蛋白。在表達(dá)上調(diào)的基因中有較多是與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，主要有E-Cad、beta-catenin、nm23和TIMP-1、2等，而表達(dá)下調(diào)的與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因主要有：Ras、VEGF、PDGF-A、Erk-／、2、c-src等。這些研究結(jié)果與我們以往的研究結(jié)果一致。

但是本研究也發(fā)現(xiàn)nm23-H1基因的高表達(dá)也可以使一些抑癌基因高表達(dá)、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的活性增強(qiáng)，提高細(xì)胞外基質(zhì)酶的活性，影響細(xì)胞骨架蛋白的合成。因此可以推測nm23-H1基因可以通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，如通過對細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的調(diào)控抑制細(xì)胞的增殖能力和克隆形成率，降低基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，抑制促進(jìn)血管生成基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。由此可見，nm23-Hl基因?qū)9981細(xì)胞惡性表型的逆轉(zhuǎn)是通過對下游相關(guān)基因的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，并且是“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級聯(lián)”中的正向調(diào)控的關(guān)鍵基因和上游基因。

總之，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是多基因、多因子共同作用的結(jié)果，并且是一至兩個(gè)關(guān)鍵基因在時(shí)間上和空間上相互配合，協(xié)同促進(jìn)了細(xì)胞的癌變、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，在研究腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制時(shí)，也應(yīng)進(jìn)行多基因的分析，而不只是局限在幾個(gè)單一基因上，基因芯片為研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及基因之間的相互作用提供了有力的研究工具。