生物技術(shù)在油菜種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用

摘 要：從胚拯救、體細(xì)胞雜交、體細(xì)胞無(wú)性系變異和基因工程4方面綜述了現(xiàn)代生物技術(shù)在油菜種質(zhì)創(chuàng)新中所取得的成績(jī)。胚挽救技術(shù)主要用于克服遠(yuǎn)緣雜交受精后的不親和，提高獲得雜種的頻率；體細(xì)胞雜交由于繞過(guò)有性雜交不親和障礙，擴(kuò)大了雜交范圍；基因工程技術(shù)借助分子操作技術(shù)，達(dá)到定向改變目標(biāo)生物遺傳物質(zhì)的目的，拓寬其種質(zhì)資源。另外，對(duì)限制生物技術(shù)在油萊種質(zhì)創(chuàng)新中的一些因素和其發(fā)展前景進(jìn)行了討論。

關(guān)鍵詞：生物技術(shù)，油菜，種質(zhì)創(chuàng)新

中圖分類(lèi)號(hào)：S565．403．53

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007—7847(2006)01—0018—06

種質(zhì)是決定生物遺傳性狀，并將遺傳信息從親代傳遞給子代的遺傳物質(zhì)，含有種質(zhì)并能繁殖的生物體即為種質(zhì)資源。種質(zhì)資源是人類(lèi)賴以存在和發(fā)展的基礎(chǔ)，它的保存和創(chuàng)新將直接關(guān)系到人類(lèi)的未來(lái)，油菜是世界范圍內(nèi)廣泛種植的油料作物之一，是世界食用植物油和植物蛋白的主要來(lái)源之一，對(duì)人們的生活起著舉足輕重的作用。然而，目前我國(guó)廣泛種植的甘藍(lán)型油菜引自歐洲，其遺傳背景比蕓薹屬其他物種狹窄，育種和生產(chǎn)中遺傳基礎(chǔ)單一的問(wèn)題十分突出，因此利用現(xiàn)代生物技術(shù)拓寬其遺傳基礎(chǔ)，擴(kuò)大其種質(zhì)資源具有重要的理論和實(shí)際意義。本文主要就胚挽救技術(shù)、原生質(zhì)融合技術(shù)、體細(xì)胞無(wú)性系變異和基因工程技術(shù)在油菜種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用現(xiàn)狀作一綜述。

1 胚挽救技術(shù)與遠(yuǎn)緣雜交

1.1 遠(yuǎn)緣雜交

遠(yuǎn)緣雜交具有能創(chuàng)造新的作物類(lèi)型、能利用異屬和異種的特殊有利性狀、能豐富作物的變異類(lèi)型、創(chuàng)造新的雄性不育源、探索研究生物進(jìn)化等重要意義。因此，遠(yuǎn)緣雜交在油菜遺傳育種中被廣泛應(yīng)用，運(yùn)用傳統(tǒng)育種方法進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交育種常常受到有性不親和性的限制，其主要表現(xiàn)為雜交后胚不能形成或者胚的發(fā)育受阻，從而導(dǎo)致幼胚易天亡，因此，一般的人工雜交較難成功，只有極少數(shù)在不經(jīng)胚拯救條件下能獲得雜交種。

1．2 胚挽救技術(shù)

胚挽救技術(shù)是指在受精完成后易發(fā)生胚敗育的雜種胚，在其停止發(fā)育前將其與母體分離，進(jìn)行人工培養(yǎng)而獲得雜種植株的技術(shù)。根據(jù)其外植體的不同，胚挽救技術(shù)包括子房培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)和胚培養(yǎng)。現(xiàn)在由于試驗(yàn)條件的限制以及遠(yuǎn)緣雜交胚比正常胚弱小等原因，很難從子房中直接剝離出幼胚進(jìn)行胚培養(yǎng)，并且子房培養(yǎng)與胚珠培養(yǎng)和胚培養(yǎng)相比，實(shí)驗(yàn)操作較為簡(jiǎn)便，而且能夠獲得比較滿意的結(jié)果，因此子房培養(yǎng)被廣泛應(yīng)用于油菜的育種實(shí)踐和遺傳研究，3種外植體培養(yǎng)方法目前不僅是克服油菜遠(yuǎn)緣雜交不親和性的主要技術(shù)，同時(shí)也是克服蕓苔屬植物受精后雜種胚敗育，提高雜種結(jié)實(shí)率的有效辦法。當(dāng)然胚挽救的成功與否常常與外植體的離體時(shí)期和基因型有密切的關(guān)系，早期的育種工作由于受到不親和性和胚敗育的限制而使許多遠(yuǎn)緣雜交工作無(wú)法開(kāi)展。胚挽救技術(shù)不僅能在一定程度上克服遠(yuǎn)緣雜交中的不親和性，也使過(guò)去人工雜交難于獲得雜種的遠(yuǎn)緣雜交，獲得了雜種，而且極大地提高了獲得遠(yuǎn)緣雜種頻率。此外，它使獲得的遠(yuǎn)緣雜種Fl代能通過(guò)無(wú)性繁殖方式保存下來(lái)，這為開(kāi)發(fā)利用植物遺傳資源，如培育油菜新品種(系)和新類(lèi)型，開(kāi)辟了一條新途徑，從而使油菜與其近緣種、屬間的遠(yuǎn)緣雜交的研究進(jìn)程不斷得以深入。目前，借助胚挽救技術(shù)已經(jīng)成功地獲得了許多遠(yuǎn)緣雜交種(表1)，眾多的實(shí)例表明，胚挽救技術(shù)作為一種育種輔助手段能夠有效地促進(jìn)遠(yuǎn)緣雜交種等新種質(zhì)的獲得和保存。目前，胚挽救技術(shù)與傳統(tǒng)雜交方式相結(jié)合已經(jīng)成為遠(yuǎn)緣雜交進(jìn)而獲得遠(yuǎn)緣雜種的有效途徑之一。

2 體細(xì)胞雜交

體細(xì)胞雜交又稱原生質(zhì)體融合，是指兩種原生質(zhì)體間的雜交。它不是雌雄配子間的結(jié)合，而是具有完整遺傳物質(zhì)的體細(xì)胞之間的融合。因此，雜交的產(chǎn)物——異型核細(xì)胞或異體核中將包含有雙親體細(xì)胞中染色體的總和及全部細(xì)胞質(zhì)．當(dāng)然，由于自然的原因，由雜種細(xì)胞再生成的雜種植株內(nèi)，染色體數(shù)目和細(xì)胞器的組成以及其他細(xì)胞質(zhì)成分還有不同程度的變化，或者由于人為的控制(如人工誘變)，也會(huì)使雜種細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，從而大大增加了后代的變異，理論上體細(xì)胞雜交可在包括種內(nèi)、種間、屬間、科間甚至界間的任何原生質(zhì)體間進(jìn)行。它能克服有性遠(yuǎn)緣雜交育種中的不親和性，從而獲得親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的體細(xì)胞雜種。

油菜的原生質(zhì)體融合技術(shù)始于20世紀(jì)70年代。通過(guò)擬南芥菜和白菜型油菜原生質(zhì)體融合獲得了自然界不存在的屬間體細(xì)胞雜種——擬南芥油菜。自20世紀(jì)70年代得到蘿卜胞質(zhì)三系后，近年來(lái)，各國(guó)科學(xué)家廣泛開(kāi)展了原生質(zhì)融合技術(shù)的研究。目前，體細(xì)胞雜交技術(shù)不僅被廣泛用于油菜的細(xì)胞質(zhì)雄性不育研究，而且也應(yīng)用于油菜的抗病、抗蟲(chóng)、抗逆境等方面的研究。Sikdar采用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得了芝麻菜(E．sativa)與芥菜型油菜(B.juncea)的屬間體細(xì)胞雜種。Faleson采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，將甘藍(lán)型油菜的下胚軸原生質(zhì)體與芝麻菜(E．sativa)的葉肉原生質(zhì)體融合，獲得雜種細(xì)胞，這些雜種細(xì)胞再生形成23個(gè)雜種植株。M．Skarzhinskaya et，al利用B．napus與LesquereUa fendleri進(jìn)行體細(xì)胞的對(duì)稱與不對(duì)稱融合，均得到了屬間體細(xì)胞雜種。胡瓊等用甘藍(lán)型油菜(且napus)與諸葛菜、新疆野生油菜進(jìn)行體細(xì)胞雜交得到了甘藍(lán)型油菜的雄性不育材料。

3 體細(xì)胞無(wú)性系變異

不經(jīng)體外選擇而在組織培養(yǎng)植株上發(fā)生的變異稱為體細(xì)胞無(wú)性系變異(somaclonalvariation)。由于組織培養(yǎng)改變了細(xì)胞分裂的正常周期，使異染色質(zhì)DNA復(fù)制更加延遲，從而使帶有異染色質(zhì)區(qū)的染色體在細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)生斷裂、引起染色體畸變，誘發(fā)轉(zhuǎn)座因子，因此，在組織培養(yǎng)條件下得到的再生植株存在著豐富的遺傳變異。這些變異也許是一種原來(lái)自然界不存在的可遺傳變異，可被用于作物的改良。另外，由于組織培養(yǎng)的環(huán)境條件可以嚴(yán)格地加以控制，我們就可以模擬出各種自然災(zāi)害條件，如培養(yǎng)基中NaCl的濃度、pH值、添加對(duì)某些作物危害最大的流行病菌毒素或者最有效的除誘劑等，組成各種特異性選擇培養(yǎng)基，從而篩選出具有對(duì)特殊自然災(zāi)害抗性、抗藥性或抗病性細(xì)胞系或再生株，為作物遺傳改良提供寶貴的種質(zhì)資源。

乙酰甲基磺酸(EMS)種子誘變結(jié)合根彎曲突變體篩選法是目前應(yīng)用較普遍的耐營(yíng)養(yǎng)脅迫突變體篩選方法。吳沿友等用呼吸代謝EMP途徑的抑制劑——碘乙酸鈉，篩選出經(jīng)EMS誘變處理的油菜幼胚培養(yǎng)苗的抗碘乙酸鈉突變體，其產(chǎn)量和含油量分別比對(duì)照提高，油分品質(zhì)提高，耐菌核病能力增強(qiáng)，成熟期提早。

盡管利用體細(xì)胞無(wú)性系變異仍存在著細(xì)胞和植株水平變異不一致等局限性，但是其作為一條安全而有效的創(chuàng)造新種質(zhì)途徑仍有著廣泛的潛在利用價(jià)值。

4 植物基因工程技術(shù)

基因工程即重組DNA技術(shù)，它不是通過(guò)一般傳統(tǒng)的有性雜交方法，而是按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，借助于分子操作技術(shù)，將某種生物的基因或基因組轉(zhuǎn)移到另一種生物中，使后者定向地獲得新的遺傳性狀，成為新的類(lèi)型。與傳統(tǒng)的有性雜交相比，轉(zhuǎn)基因技術(shù)有如下兩方面的顯著特點(diǎn)：1)目的基因來(lái)源明確，性狀改造預(yù)見(jiàn)性強(qiáng)；2)育種年限顯著縮短。轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)移的僅僅是目的基因本身及相關(guān)的選擇標(biāo)記，不涉及龐大的遺傳背景，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過(guò)1～2代自交即可獲得純合的轉(zhuǎn)基因品系，目前在油菜種質(zhì)創(chuàng)新中，利用基因工程技術(shù)可以改良其蛋白質(zhì)成分，提高必需的氨基酸含量，改變脂肪酸組成，培育抗病毒、抗蟲(chóng)等新品種，從而增加油菜的種質(zhì)資源。

4.1 獲得品質(zhì)改良的轉(zhuǎn)基因油菜

通常情況下，油菜種子的油脂和蛋白質(zhì)含量分別為40％和20％，Stoatiesdijk等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化油酸減飽和共抑制結(jié)構(gòu)基因，獲得了種子油酸含量分別高達(dá)89％、73％轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜和芥菜型油菜。陳錦清等從光合產(chǎn)物分配角度，利用反義PEP基因技術(shù)創(chuàng)制超油油菜新種質(zhì)，成功地選育了轉(zhuǎn)基因油菜超油1號(hào)和超油2號(hào)，其含油量分別高達(dá)47．84％和52．7％，Vesna等將擬南芥(Arabidopsisthaliana)的脂肪酸延伸酶基因fael導(dǎo)入加拿大油菜的栽培品種Hero中，轉(zhuǎn)基因的植株種子芥酸的含量和油脂的產(chǎn)量均超過(guò)對(duì)照。石東喬等將反義油酸脫飽和酶基因(Fad2基因)導(dǎo)入油菜，獲得的轉(zhuǎn)基因油菜種子油酸含量升高，亞油酸、亞麻酸含量降低，其中油酸最高含量為68．72％，比對(duì)照提高20％以一。

4．2 獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因油菜

將編碼除草劑失活酶的Bar基因、Pat基因、aroA基因(編碼5—烯醇丙酮酰草酸酶的一種點(diǎn)突變基因)導(dǎo)人油菜，可獲得對(duì)除草劑的抗性。Kumar等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將Pat轉(zhuǎn)入油菜，獲得了抗廣譜除草劑2—氨基4－丁酮酸的轉(zhuǎn)基因植株。目前，加拿大批準(zhǔn)的抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜品種如LG3315、LG3295、NCN92、GT73、GT200等已進(jìn)入商品化生產(chǎn)。美國(guó)FAD批準(zhǔn)了抗草甘膦、抗草丁膦等轉(zhuǎn)基因油菜進(jìn)入商品化生產(chǎn)。

4.3 獲得抗病轉(zhuǎn)基因油菜

病毒病和真菌病是制約油菜生產(chǎn)的兩大病害，“雙低”油菜品種，對(duì)真菌病害更加敏感。采用傳統(tǒng)的育種方法選育到真正抗真菌病的新品種比較困難，因此，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到的抗病毒病、真菌病的新種質(zhì)具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

在抗病毒病轉(zhuǎn)基因油菜研究過(guò)程中，一般采用病毒的甲基因和對(duì)病毒具廣譜抗性的商陸pap基因。陳軍等利用激光微束穿刺法將TuMV的甲基因?qū)胗筒诵℃咦又校晒Λ@得了轉(zhuǎn)基因油菜。張海燕等以油菜子葉柄為材料，采用激光微束穿刺法，將損傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制之下的pap導(dǎo)入油菜H165中，經(jīng)慶大霉素篩選，獲得了抗性再生植株，經(jīng)檢測(cè)，pap連同損傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子已穩(wěn)定整合至油菜基因組中，接種TuMV的攻毒試驗(yàn)表明，80％的轉(zhuǎn)基因植株未出現(xiàn)病毒引起的花葉和葉片皺縮等癥狀。

利用基因工程手段進(jìn)行的抗真菌病研究，一般采用β-1，3葡聚糖酶基因及幾丁質(zhì)酶基因，張麗華等將幾丁質(zhì)酶單基因或幾丁質(zhì)酶和β1，3葡聚糖酶雙價(jià)基因?qū)敫仕{(lán)型油菜，均獲得了H165抗菌核病材料。

4．4 獲得抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因油菜

目前主要利用蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)即9J毒素蛋白基因轉(zhuǎn)移到油菜中，蘇云金芽桿菌的某種殺蟲(chóng)性細(xì)菌能夠合成某些昆蟲(chóng)致死的蛋白質(zhì)，從而獲得抗蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因油菜。官春云等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和子房注射法成功地將將BT毒素蛋白基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜品種湘油13號(hào)，選育了遺傳穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)抗蟲(chóng)油菜新品系。該品系對(duì)菜青蟲(chóng)有明顯的抗蟲(chóng)性，菜青蟲(chóng)存活率明顯降低，不足20％，而對(duì)照存活率高達(dá)70％。此外，菜青蟲(chóng)取食速度降低、成蛹體重減輕，中高齡幼蟲(chóng)歷期延長(zhǎng)，品系抗蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)十分顯著，李學(xué)寶等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗蟲(chóng)基因cry／A／導(dǎo)入油菜，也獲得了油菜抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)其抗性和后代株系進(jìn)行了分析研究。

4．5 創(chuàng)造新的油菜雄性不育系、恢復(fù)系和保持系

利用常規(guī)的育種方法來(lái)選育不育系存在周期長(zhǎng)，見(jiàn)效慢，不育基因單一，對(duì)環(huán)境因素影響敏感等問(wèn)題，遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)發(fā)展的需要．通過(guò)基因工程創(chuàng)造油菜雄性不育系及其恢復(fù)系可以縮短育種時(shí)間。有效地解決常規(guī)育種手段的局限性。目前利用基因工程創(chuàng)造雄性不育系主要是利用花粉發(fā)育的特異啟動(dòng)子與外源基因連在一起，構(gòu)建成植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化油菜來(lái)阻斷花粉的發(fā)育從而達(dá)到雄性不育的目的。Mariani等將編碼核糖核酸的基因置于TA29啟動(dòng)子(花藥絨氈層特異表達(dá)啟動(dòng)子)控制之下，構(gòu)成嵌合基因，并使嵌合基因與Bar基因(抗除草劑PPl)連接一起轉(zhuǎn)化油菜。TA29在花藥絨氈層特異表達(dá)，導(dǎo)致花粉敗育。從而獲得油菜雄性不育系，恢復(fù)系為轉(zhuǎn)核糖核酸酶抑制劑基因，保持系為非轉(zhuǎn)基因油菜品種，保持系與不育系雜交后代的分離，可通過(guò)除草劑進(jìn)行篩選(不育系抗PPT)。

5 轉(zhuǎn)基因油菜新種質(zhì)的安全性分析

轉(zhuǎn)基因植株的安全性主要包括食品安全性和環(huán)境安全性兩方面．食品安全性是指人們食用轉(zhuǎn)基因食品后，盡管其中絕大部分DNA已降解，并在腸胃中失活，但極小部分是否會(huì)有安全性的問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因所使用的抗生素抗性篩選基因?qū)θ梭w健康可能造成的不利影響，目前人們認(rèn)為這些可能性都比較小，標(biāo)記基因?qū)е轮尾r(shí)抗生素不起作用的風(fēng)險(xiǎn)也可以忽略不計(jì)。轉(zhuǎn)基因的環(huán)境安全性主要指基因漂流或基因擴(kuò)散，轉(zhuǎn)基因可能轉(zhuǎn)移到雜草，產(chǎn)生抗除草劑的超級(jí)雜草；或者向其他作物轉(zhuǎn)移，改變其性狀，從而對(duì)生態(tài)環(huán)境和生物多樣性造成潛在的危害性，宋小玲等用3種類(lèi)型油菜(Brassica slop)和野芥菜(且扣ncea var gracilisTsen ecLee)雜交，發(fā)現(xiàn)白菜型油菜向野芥菜的基因漂流可能性最小，甘藍(lán)型居中，而芥菜型極易向野芥菜發(fā)生基因漂流。另外，他還發(fā)現(xiàn)抗除草劑基因油菜的抗性基因向諸葛菜漂移的可能性小。S．I．Warwick et al發(fā)現(xiàn)從轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜向藍(lán)花子和新疆野生油菜漂流基因的可能性非常低(<2～5×10^-5)，然而，轉(zhuǎn)基因經(jīng)過(guò)蕪菁能夠在環(huán)境中擴(kuò)散．利用葉綠體轉(zhuǎn)化可以有效地控制由于外源基因擴(kuò)散而引起的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性。在油菜中，利用葉綠體轉(zhuǎn)化可以控制外源基因的擴(kuò)散已得到大田試驗(yàn)的證實(shí)。Scott和Wilkinson對(duì)葉綠體轉(zhuǎn)基因油菜保持外源基因的情況下，發(fā)現(xiàn)葉綠體轉(zhuǎn)基因油菜擴(kuò)散外源基因的可能性非常小。

6 展望

生物技術(shù)在油菜種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用已展示出了廣闊的前景。現(xiàn)代生物技術(shù)將油菜種質(zhì)創(chuàng)新從個(gè)體、細(xì)胞水平提高到了基因水平，可以克服常規(guī)育種的許多局限性，提高育種效率，實(shí)現(xiàn)育種新突破，從而創(chuàng)造出許多自然界不存在的新種質(zhì)．如通過(guò)胚拯救、體細(xì)胞雜交可以克服常規(guī)育種中遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙；通過(guò)體細(xì)胞無(wú)性系變異實(shí)現(xiàn)快速定向抗性育種；通過(guò)基因工程技術(shù)得到了抗蟲(chóng)、抗病和抗除草劑的新品種(系)，創(chuàng)造新的雄性不育材料，為充分利用油菜的雜種優(yōu)勢(shì)奠定基礎(chǔ)，然而，胚挽救、體細(xì)胞雜交和無(wú)性系變異成功率非常低，現(xiàn)有的遺傳轉(zhuǎn)化效率也很低，因此，真正得到能夠應(yīng)用于油菜育種的新種質(zhì)非常困難。總之，如何建立最佳的胚培養(yǎng)體系、原生質(zhì)融合體系、實(shí)用性較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化體系(簡(jiǎn)單、快速及高效)以及提高產(chǎn)品的安全性研究將是生物技術(shù)應(yīng)用于油菜種質(zhì)創(chuàng)新今后的研究方向。