柑橘鱗皮病研究進展

呂嬋娟　周常勇

摘要柑橘鱗皮病是一種分布在包括南美洲和地中海等廣大地區的重要病毒性病害，隨著大量國外優良柑橘品種的引進，增加了柑橘鱗皮病隨同苗木、接穗傳入我國的可能性。本文對柑橘鱗皮病的類型、研究歷史、病原、傳播方式、檢測技術以及防治方法作一綜述，為今后我國對柑橘鱗皮病的檢疫和防治研究提供基礎。

關鍵詞柑橘鱗皮病；鱗皮病A；鱗皮病B；檢測技術

中圖分類號S 435．131．49

柑橘鱗皮病是由柑橘鱗皮病毒(Citrus Psorosis CPV)引起的一種病毒性病害，主要分布在美洲和地中海等地區的國家，造成了十分嚴重的危害。隨著對該病害研究的深入特別是分子檢測技術的發展，國外對柑橘鱗皮病有了較為全面的認識，然而我國在柑橘鱗皮病方面尚缺乏系統研究。鑒于目前我國大量引進國外優良柑橘品種，增大了柑橘鱗皮病傳人我國的可能，因此對鱗皮病應予以較全面研究。本文就目前國內外柑橘鱗皮病的研究進行綜述。

1鱗皮病的類型

一般認為鱗皮病有鱗皮病A和B兩種類型。鱗皮病B也被稱為環斑病(ringspot)。基于具有相同或相似的嫩葉癥狀，囊膠病(concave gum)、雞冠皮病(cristacortis)和石果病(impietratura)被認為與鱗皮病屬于同一類群，但它們的病原性質還沒有確定；柑橘皺葉病(citrus crinkly leaf)、柑橘雜色花葉病(citrusvaregation)亦曾和鱗皮病歸于同一類群，但后來實驗證明，它們是另外的病毒引起的。

2病害的歷史

Swingle和Webber最早于1896年在佛羅里達觀察到柑橘鱗皮病癥狀，但當時并不了解其病因。Fawcett觀察到柑橘嫩葉出現花葉并伴隨樹皮鱗片的癥狀是由一種病毒引起的，并將該病毒命名為CPV。Wallace等發現了另一種鱗皮病癥狀，并將引起這種癥狀的病毒命名為柑橘環斑病毒(Citrusringspot virus，CRSV)。CPV和CRSV在葉片和樹皮上表現類似的癥狀，但各自的嚴重程度不同，過去常被視為不同的病害，但現在已被視為同一種病害。

Wallace報道鱗皮病A和鱗皮病B間具有交叉保護作用，即在感染了鱗皮病A的植株上接種鱗皮病B，癥狀會明顯減輕。

3病原

CPV屬于新成立的蛇形病毒屬(Ophiovirus)，病毒粒子具有裸露的線形核衣殼，直徑約3 nm，可形成卷曲的環(內部可能有盤繞)。Derrick等報道該病毒粒子包含了T、B兩個組分，其中T組分的長度為300～500nm，B組分為1 500～2 500nm，它們能在不同的蔗糖濃度梯度下被分離，能編碼包含48kD的衣殼蛋白(CP)，只有這兩部分同時存在時病毒才具有侵染性。隨后的研究表明CPV至少包含3個組分，即T1RNA、T2RNA和BRNA，基因組總長11～12kb，分別為1．6～1．8kb、1，5kb、7．5—9．0kb。T1RNA包含一個ORF，編碼由476個氨基酸組成的分子量約54kD的衣殼蛋白；T2RNA包含一個ORF，編碼含436個氨基酸、分子量約49kD的衣殼蛋白；BRNA則包含兩個ORF，分別編碼280kD和24kD的衣殼蛋白。

4寄主范圍和癥狀

柑橘鱗皮病主要危害甜橙、寬皮柑橘和葡萄柚等。鱗皮病A引起寄主主干和大枝樹皮呈鱗片狀開裂，木質部充膠變色，春、秋梢嫩葉呈現橡形葉癥狀以及沿葉脈褪綠斑紋，少數春梢會表現較輕的休克癥狀，隨葉片老化后癥狀消失；鱗皮病B引起老葉亦顯環斑癥狀，果實呈現環形凹陷斑，樹皮癥狀蔓延快，小枝上呈現木栓化，隆起的浸膠斑點。另外有報道在加利福尼亞和南美洲等一些地方，一些被柑橘鱗皮病侵染后的植株并不表現癥狀。

5病害傳播

鱗皮病除嫁接傳播外，還可通過機械方法從柑橘向柑橘或草本植物傳播。Campiglia等報道，在烏拉圭的250株枳橙上有1％表現了鱗皮病癥狀，從而表明鱗皮病可以通過種子進行傳播。另外，Levy等報道CPV可通過微內藏菟絲子(Campestrissubinclusa)在柑橘與草本植物間進行傳播。柑橘鱗皮病在阿根廷、烏拉圭、印度等國家的自然傳播仍然未完全得到證實，但在阿根廷，蚜蟲是可能的潛在自然介體。

6防治方法

通過指示植物鑒定，莖尖嫁接脫毒或熱處理獲得無鱗皮病母樹，培育無病苗木可以有效防治此病。由于囊膠病可以通過枳和枳橙的種子傳播，砧木種子、母樹也需要通過鑒定無病方可使用。

7檢測方法和技術

7．1指示植物鑒定

Wallace首次用柑橘苗作為指示植物鑒定鱗皮病A。常用的木本指示植物有鄧肯葡萄柚、墨西哥來檬、甜橙和香櫞等。其中，甜橙是最佳的指示植物，癥狀主要表現為新生葉片褪綠斑駁，呈黃色的環斑和污斑，明脈和葉脈環阻等；常用的草本指示植物有昆諾藜、美麗菜豆、黑眼豇豆等，癥狀表現為接種葉上產生局部壞死枯斑。研究表明，木本指示植物接種后的前28d對癥狀的表現至關重要，低溫更容易促進癥狀的表現，如鱗皮病A在白天最高溫度24—27℃，夜間最低溫度18～21℃時癥狀表現最為明顯。

7．2血清學鑒定

Clark等利用雙抗體夾心ELISA法(DAS-ELISA)，隨后又運用三抗體夾心ELISA(TAS-ELISA)法對CPV進行檢測。在意大利，人們利用DAS-ELISE和TAS-ELISE對田間苗圃進行CPV的實測。Garcia等制備了多種CPV的多克隆和單克隆抗體，并使用來自佛羅里達的CtRSV-4的抗血清對美國、阿根廷、西班牙、意大利的20個不同的CPV株系進行檢測，結果表明，該方法可以檢測出大部分株系。但由于該病毒存在多個株系和血清型，所以血清學的方法均不能同時檢測鱗皮病的所有株系。130nghia等用直接組織點免疫法(DTBIA)對CPV進行了檢測。

7．3分子雜交

Barthe等發展了基于CPV衣殼蛋白基因(CPG)的分子雜交檢測技術，利用32P-CDN探針檢測出來自加利福尼亞的CPV-4和CPV-6等株系。Martin等，在其基礎上利用探針檢測出柑橘環斑病株系P-121。

7．4PCR檢測方法

Garcia等對CtRSV-4的cDNA片段進行克隆和測序，并由此設計了一對引物用于檢測柑橘鱗皮病的CtRSV-4、CpSAV90—1—1和其他4個來自美國和阿根廷的柑橘鱗皮病分離株。Legarreta根據T1RNA和BRNA的部分序列設計出了兩對引物，結果TI—引物能檢測出23個來自阿根廷、美國自西班牙和意大利的分離株。同年，Barthe等克隆了CPV的CPGESJ，并發展了基于CPG序列的PCR檢測方法，分別擴增出了600 bp的部分CPG序列和1 317bp完整的CPG。隨后Legarreta等又在常規PCR的基礎上發展了半巢式RT-PCR，根據CPV的RNAl設計了一對半引物對來自阿根廷的6個株系進行檢測，結果表明這6個株系具有很高的同源性，這種方法與常規PCR相比具有更高的靈敏度。最近，Martin等根據CPV的RNA3設計了一對引物，建立了一步法RT-PCR，大大縮短了PCR的時間。

綜上所述，國外對柑橘鱗皮病的研究起步早，現對柑橘鱗皮病的發生和檢測技術的研究已比較成熟，而國內除中國農業科學院柑橘研究所病毒組應用指示植物鑒定該病害外，尚未涉及該病害的分子檢測研究。鑒于該病害的危險性以及植物檢疫工作快速檢測的需要，加強對柑橘鱗皮病的研究，建立一套快速、準確的分子生物學檢測技術，對我國柑橘優良品種的引進和推廣安全，防止柑橘鱗皮病在我國的進一步擴散，確保我國農業生產安全和對外貿易的順利進行等方面具有重要意義。