轉(zhuǎn)基因抗病毒病四倍體西瓜的培育

摘 要：利用西瓜花葉病毒2號(WMV-2)外殼蛋白(CP)基因、小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)復(fù)制酶(NIb)基因和黃瓜花葉病毒(CMV)復(fù)制酶基因構(gòu)建三價基因的植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化四倍體西瓜植株，經(jīng)分子檢測證明目的基因成功地導(dǎo)人西瓜植株，并在后代中穩(wěn)定遺傳。經(jīng)溫室及大田接種鑒定，T3代轉(zhuǎn)基因西瓜抗病毒性達中抗水平，為抗病毒無籽西瓜新品種的培育提供了可能性。

關(guān)鍵詞：四倍體西瓜；病毒病；轉(zhuǎn)基因；抗病性

病毒病是西瓜三大主要病害之一，在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生。我國所有的西瓜種植區(qū)域均不能幸免，常年發(fā)病面積達10萬hm²，年經(jīng)濟損失達1.5億元。尤其在安徽、河南、河北、山東、山西、陜西等我國西瓜主產(chǎn)省區(qū)，病毒病的發(fā)生最為嚴(yán)重，且三倍體無籽西瓜病毒病的發(fā)生重于二倍體西瓜，目前尚無農(nóng)藥能有效地進行防治，不少田塊因病毒病而絕收。因此，培育抗病毒病無籽西瓜新品種，是西瓜生產(chǎn)中亟待解決的問題。

1991—1997年，黃學(xué)森研究小組將WMV-2的CP基因?qū)胛鞴现仓辏@得抗性材料，并獲農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，進行安全釋放試驗。2002年，王慧中等將WMV-2的CP轉(zhuǎn)入西瓜，獲得了抗WMV -2的純合系。西瓜在大田遭受多種病毒的侵害，其中主要有3種病毒：WMV-2，ZYMV，CMV。抗1種病毒的轉(zhuǎn)基因抗病材料不適合直接在生產(chǎn)中應(yīng)用。美國As-grow種子公司，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，曾將WMV-2、CMv、ZYMv這3種病毒的CP基因成功轉(zhuǎn)入西葫蘆植株，獲得了抗病毒病西葫蘆新品種，并已獲準(zhǔn)上市。根據(jù)CP和復(fù)制酶基因介導(dǎo)的抗性特點，1998年以來，筆者將WMV-2CP基因、ZYMV復(fù)制酶基因、CMv復(fù)制酶基因構(gòu)建成植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化二倍體西瓜植株。經(jīng)分子檢測和抗病毒鑒定，篩選獲得的轉(zhuǎn)基因西瓜株系表現(xiàn)出較好的抗病性能，隨后筆者將三價外源基因轉(zhuǎn)入四倍體西瓜，也獲得了抗性植株。

1 材料與方法

1．1 材料

細菌菌株、質(zhì)粒、寡核苷酸引物、植物表達載體的構(gòu)建，與筆者培育轉(zhuǎn)基因抗病毒病二倍體西瓜相同。植物表達載體的構(gòu)建策略圖見圖1：

1．2 西瓜外植體培養(yǎng)

基因受體為本單位自己培育的新四倍體單系H-8，用子葉作為外植體，四倍體與二倍體的子葉培養(yǎng)沒有本質(zhì)區(qū)別，但四倍體的再生能力不如二倍體。其培養(yǎng)方法與黃學(xué)森等1994年，牛勝鳥、黃學(xué)森等2005年所做試驗相同，種子去殼，在0.1％升汞溶液中消毒8～10min，用無菌水沖洗3次，在1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每20粒種子接種1瓶，16h光照，8h黑暗，光照度1500～2000lx，日光燈光源。培養(yǎng)溫度：光照時(26±1)℃，黑暗時(22±1)℃。切取5d左右苗齡的子葉，培養(yǎng)在M1培養(yǎng)基上，M1以MS為基礎(chǔ)，加入2，25m/L的6-BA，每瓶接種15片子葉。

1．3 西瓜植株的遺傳轉(zhuǎn)化

離體子葉在M1培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周左右，在近軸端的葉脈處，出現(xiàn)微小的愈傷突起時與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)。將固體培養(yǎng)基上的菌落，刮到液態(tài)LB+Kan+Sm培養(yǎng)基中，在26～28℃下，培養(yǎng)12～19h，菌液OD₂₆₀約0.8時備用。子葉在菌液中浸泡5～8min，濾干多余菌液后放回M1培養(yǎng)基，1周后移入Ml+Kan100mz/L+Cb100mg/L的培養(yǎng)基上。以后每2周換1次同樣的培養(yǎng)基，1個月左右，愈傷突起發(fā)育成芽叢，將這些芽叢轉(zhuǎn)移到M2培養(yǎng)基上，M2培養(yǎng)基為MS+KT0.2 mG/L+Kan100 mG/L+Cb100mG.L。2周左右，幼芽伸長至2cm左右，切下幼芽，嫁接到砧木上，在人工氣候箱中煉苗，然后將植株轉(zhuǎn)入溫室生長、開花、結(jié)果。

1．4 外源基因的PCR檢測

小苗在溫室生長時，取約0.1g的葉片，按SDS-KAc方法，小量提取植株總DNA，分別用引物WMVS-1、WMVS-2，ZS-1、ZS-2，CMV-3、CMV-4進行PCR檢測，保留PCR陽性植株。

1．5 外源基因的Southern-blot檢測

按照SDS-KAc方法大量提取PCR陽性植株葉片的總DNA，Hind III酶切后Southern-Blot驗證。

1．6 抗病性鑒定

將當(dāng)代陽性植株采集的種子T0代，在農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)生物基因工程安全委員會批準(zhǔn)的試驗田中，繁殖第2代并獲種子T1，T1發(fā)育成的第3代植株分別在網(wǎng)室和試驗田進行病毒接種。網(wǎng)室內(nèi)只安排部分單系的少數(shù)種子，在排除外來干擾的情況下，觀察接毒情況和病情發(fā)展。大田試驗的目的，主要是為了獲得抗病材料，行距為1.5m，株距10cm。 網(wǎng)室與大田的接毒方法相同。將WMV-2、ZYMV病葉，在0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中磨碎，稀釋10倍，于西瓜幼苗的3葉期磨擦接種，將病毒接種于2片真葉上。20d后第1次檢查發(fā)病情況，以后每隔1周對部分單系跟蹤調(diào)查。第1次檢查后，將大田中2級以上病株拔除，留下抗病株結(jié)瓜。

病情分級如下：

0級：無病：

1級：植株1/3葉片表現(xiàn)病毒病癥狀，但不影響生長：

2級：植株1/2葉片表現(xiàn)病毒病癥狀，輕度影響生長；

3級：2/3葉片表現(xiàn)病毒病癥狀，嚴(yán)重影響生長，不能坐瓜或果實失去商品性：

4級：2/3以上葉片表現(xiàn)病毒病癥狀，植株嚴(yán)重矮化枯萎或接近死亡，沒有產(chǎn)量：

0、1、2級，一般通稱抗病植株，3、4級通稱感病植株。

在網(wǎng)室內(nèi)取部分抗病、感病植株，進行ELISA檢測，檢查病毒含量。抗病株自交，測定產(chǎn)量和果實可溶性固形物含量，觀察果實形狀，與原受體品種比較是否變異。采收種子。

2 結(jié)果與分析

2．1 外植體的轉(zhuǎn)化

四培體西瓜子葉分化胚狀體的百分率明顯低于二倍體，本品種在M1培養(yǎng)基上子葉分化率為15％左右。1kZ種子，播500瓶，切1000瓶子葉，在篩選培養(yǎng)基上成苗286株，再生率約為1.9％：轉(zhuǎn)入培養(yǎng)土，移入溫室，并收獲種子的為75株，最終再生率約為0.5％：經(jīng)PCR-電泳檢測，陽性植株為23株，陽性率為31％。其再生率低于二倍體，陽性率與二倍體基本相同。

2．2 外源基因的PCR-Southern檢測

70代106個樣品中有25個樣品呈PCR陽性，陽性率占24％(圖2)。

2．3 外源基因的Dot-blot和Southern-blot檢測

在PCR檢測基礎(chǔ)上，用WMV-2CP基因為探針，進行了點雜交檢測，同時選取內(nèi)源單拷貝基因(絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶)作上樣內(nèi)參照(圖3)。從圖3可看出，用sat探針進行雜交，結(jié)果表明樣品之間總DNA上樣量差別不大，根據(jù)WMV-2CP探針的雜交結(jié)果可以初步認(rèn)定轉(zhuǎn)基因植株1，2，3，4，5，7，9，10為陽性植株，基因組經(jīng)HindⅢ酶切后而進行的Southern-blot檢測證明樣品7為陽性植株，這說明外源基因成功地轉(zhuǎn)入了西瓜植株(圖4)。

2．4 轉(zhuǎn)基因后代植株的抗病性鑒定

陽性植株的T2代421個單系約5800株，于3葉期人工接種WMV-2和ZYMV后，2周植株開始發(fā)病，接種后20d開始調(diào)查發(fā)病情況：非轉(zhuǎn)基因植株對照病情指數(shù)100，轉(zhuǎn)基因單系病情指數(shù)為20～100，病情指數(shù)20～50的占20％，50～80的占30％，80～100的占50％。

第2、3、4……次發(fā)病調(diào)查，原0、1級的植株不斷地變?yōu)?、4級，接種40d左右是病變高峰。個別病株，由原來的3、4級，逐漸緩和病情，長出趨向正常的葉片。到采收西瓜時，約有100株病級為0、1級。選取6株抗病性最好、農(nóng)藝性狀也最好的單瓜繁殖下一代，再做抗病毒鑒測，病情指數(shù)為20～50，抗病毒性能良好。轉(zhuǎn)基因西瓜的農(nóng)藝性狀與受體品種沒有差異。單株與單株有些不同，屬正常范圍。具體結(jié)果見表1。

BH-I的特性、特征：果實圓球形，綠色果皮覆墨綠齒條，外觀似京欣l號；紅瓤。脆質(zhì)，中心可溶性固形物含量11.5％，邊部為8％，多汁爽口。植株生長穩(wěn)健，除抗病毒病外，還高抗枯萎病。易坐瓜，第9節(jié)出現(xiàn)第1朵雌花，以后每隔6～8節(jié)再現(xiàn)雌花，中早熟品種，全生育期93d左右，開花至果實成熟31d。

為了檢測T3代轉(zhuǎn)基因植株的純合度及具體的抗感程度，選取15株抗病性好、農(nóng)藝性狀也較好的T2代單瓜，在溫室種植繁殖下一代，每個單系種8株，3葉期人工接種ZYMV，同時釆葉片小量提取DNA進行PCR檢測以估計純合度。經(jīng)PCR檢測，有3個單系的植株均為陽性，抗病性檢測結(jié)果見表2。

從表2可看出，121單系有2株高抗，2株恢復(fù)，4株感病；81單系有2株高抗，2株恢復(fù)，4株感病；83單系有2株高抗，4株恢復(fù)，1株延遲，1株感病；非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?株均感病。同對照相比，3個單系均有植株達到高抗甚至免疫水平，其中83單系有1/2的植株表現(xiàn)為恢復(fù)，只有1株為感病。

3 結(jié)論和討論

本試驗將WMV-2外殼蛋白基因、ZYMV復(fù)制酶基因、CMV復(fù)制酶基因，成功導(dǎo)人西瓜植株，轉(zhuǎn)基因植株對瓜類作物主要病毒有明顯抗性，有的植株甚至達到免疫，這在西瓜生產(chǎn)上有很高的利用價值。

在對T3代植株的檢測過程發(fā)現(xiàn)，單系內(nèi)PCR檢測均為陽性的植株間抗性表現(xiàn)仍不完全一致，推測T3代的外源基因還存在分離。單系間抗性表現(xiàn)也有差異，可能是外源基因的插入位置不同所引起。這些還需進一步的實驗證實。

在對TO代植株的檢測中，PCR陽性植株點雜交也為陽性，根據(jù)內(nèi)源探針的雜交結(jié)果可排除外源基因點雜交的假陽性，但酶切Southern雜交陽性率卻很低，具體原因尚不清楚，也許是TO代植株葉片中攜帶有農(nóng)桿菌，造成了點雜陽性的假象，或者是提取的基因組DNA含糖量太高，影響了Southern雜交結(jié)果。

在接種試驗中，ZYMV毒源為中國分離物，而用來轉(zhuǎn)化的ZYMV復(fù)制酶基因來源于新加坡分離物，2種分離物在轉(zhuǎn)化的復(fù)制酶基因區(qū)域只有83％的序列同源性，根據(jù)復(fù)制酶介導(dǎo)的抗性特點——株系特異性，有些單系抗性較弱可能是由于接種的病毒株系所致。

在抗病毒篩選中，接種病毒液中病毒顆粒的濃度很難量化，接種傷口的大小很難十分一致，兩者都會影響發(fā)病的速度和程度，有待于找出最理想的方法。

作者簡介：黃學(xué)森，男，研究員，主要從事西瓜育種及生物技術(shù)研究。