瓜類作物單倍體育種研究進(jìn)展

摘 要：綜述了瓜類作物單倍體育種的研究進(jìn)展，包括花藥培養(yǎng)、未授粉子房培養(yǎng)和輻射花粉誘導(dǎo)單倍體培養(yǎng)在瓜類作物育種中的應(yīng)用；總結(jié)了近年來所采用的瓜類作物染色體倍性鑒定方法和加倍技術(shù)；討論了目前這些領(lǐng)塌存在的問題和今后研究的方向。

關(guān)鍵詞：瓜類；單倍體；誘導(dǎo)；育種

隨著植物組織、器官和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷深入與發(fā)展，單倍體材料以其獨(dú)特的優(yōu)勢在作物育種中得到了廣泛的關(guān)注與應(yīng)用。在瓜類作物中，自發(fā)產(chǎn)生單倍體的頻率極低，為了獲得單倍體。研究者們嘗試了用花藥培養(yǎng)、未授粉子房離體培養(yǎng)、輻射花粉誘導(dǎo)的孤雌生殖等手段誘導(dǎo)單倍體。據(jù)報道，目前南瓜屬、葫蘆屬、西瓜屬和苦瓜屬等5個屬均已獲得了單倍體，有的已在育種中應(yīng)用。

1 花藥培養(yǎng)

花藥培養(yǎng)是以花藥為外植體，在單核期誘導(dǎo)小孢子分裂形成胚狀體或胚性愈傷組織，然后誘導(dǎo)芽并進(jìn)一步產(chǎn)生單倍體植株，Dryanovska和Illeva用甜瓜花藥培養(yǎng)產(chǎn)生了單倍體植株：在國內(nèi)，薛光榮和陶正南等，分別報道了成功獲得西瓜和甜瓜花粉植株，但由于誘導(dǎo)率低，重復(fù)性差，未能有效用于西瓜和甜瓜的育種中。

總的來講，瓜類作物通過花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體難度較大，只有西瓜的花藥培養(yǎng)較為成功。Xue等于1981年利用瓊酥西瓜品種，通過培養(yǎng)單核靠邊期的花藥在國際上首次獲得了西瓜單倍體植株，并從其加倍后代中選育出了優(yōu)良新品種，袁萬良等通過研究解決了愈傷組織褐變死亡的問題，將分化階段愈傷組織的誘導(dǎo)率從0.5％提高到94.4％。魏英在4℃和10℃的低溫條件下進(jìn)行預(yù)處理，降低了花藥壁愈傷組織的形成，提高了花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率。

在南瓜花藥培養(yǎng)上，直到1998年，Metwany等才成功得到了10株單倍體植株，并對培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)單核中期和單核晚期的南瓜小孢子接種在MS+15％蔗糖+5mg/L2.4-D培養(yǎng)基上培養(yǎng)效果較好，每塊愈傷組織植株再生頻率可達(dá)19.2％。

在甜瓜的花藥培養(yǎng)上，Dryanovska等曾做過嘗試，結(jié)果以失敗告終。最早報道黃瓜花藥培養(yǎng)的是日本的西貞夫，他指出黃瓜花藥愈傷組織形成率對生長素的反應(yīng)是敏銳的，其增殖也遠(yuǎn)比其他蔬菜迅速，但將其白中微帶黃色的愈傷組織移植到分化培養(yǎng)基上僅見畸形莖葉的分化，卻最終不能育成成體植株。Lazarte等對黃瓜花藥進(jìn)行培養(yǎng)的結(jié)果表明，深綠色的愈傷組織常常分化為胚狀體及分生組織，胚狀體可進(jìn)一步發(fā)育為幼苗，Ashok等通過黃瓜花藥培養(yǎng)方法獲得了單倍體植株，探討了預(yù)處理、生長因子對黃瓜花藥培養(yǎng)的影響，認(rèn)為4℃預(yù)處理2d的黃瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)率及胚胎誘導(dǎo)率最高。通過對生長因子的研究結(jié)果表明，生長素中2.4-D比其他生長素效果更佳，最佳濃度為2.0μmol/L：細(xì)胞分裂素BA優(yōu)于KN、TDZ，且誘導(dǎo)培養(yǎng)基中低濃度的細(xì)胞分裂素有利于啟動雄核發(fā)育：同時ABA可促進(jìn)子葉型胚的正常生長并發(fā)育成完整植株，對細(xì)胞胚性的保持具有較好的作用，此外黃瓜花藥可以通過直接胚狀體和愈傷組織途徑獲得單倍體植株，且花藥培養(yǎng)受基因型的影響。Kunmar等對黃瓜花藥培養(yǎng)的碳源及氨基酸的研究表明，花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)的最佳碳源為蔗糖，濃度為0.25mol/L；混合氨基酸(谷胱氨酸，甘氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸)在一定濃度范圍內(nèi)的效果比單一氨基酸的效果更好，這說明黃瓜花藥培養(yǎng)需要較為充足的營養(yǎng)環(huán)境。

2 子房培養(yǎng)

瓜類作物通過花藥培養(yǎng)途徑誘導(dǎo)單倍體較困難，鑒于大孢子也是單倍性的，研究者又嘗試用雌核發(fā)育途徑誘導(dǎo)單倍體，并取得了一定的進(jìn)展。雌核發(fā)育主要包括離體條件下的雌核發(fā)育和活體條件下的雌核發(fā)育兩個方面，在瓜類作物中，主要通過未授粉子房和輻射花粉授粉后的子房進(jìn)行離體培養(yǎng)2種途徑。

2．1 未授粉子房離體培養(yǎng)

通過未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體在黃瓜、甜瓜、南瓜屬上均已見成功的報道，G6mesne等耐黃瓜未授粉子房培養(yǎng)的條件進(jìn)行過很多探索。1997年，他們?nèi)?.5-1.0cm長的黃瓜子房通過離體培養(yǎng)首次在黃瓜上獲得的了單倍體植株，由于誘導(dǎo)條件和取材大小的原因，誘導(dǎo)頻率很低。2002年，他們對6種不同基因型的黃瓜進(jìn)行了取材時期和預(yù)處理方式的研究，發(fā)現(xiàn)雌花開放前6h時胚囊剛好形成，胚的誘導(dǎo)頻率最高，同時發(fā)現(xiàn)熱處理可以提高最適發(fā)育階段雌配子的雌核發(fā)育頻率。他們采用的黃瓜胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為CBM附加不同濃度的TDZ(0.02～0.10mg/L)，適宜的蔗糖濃度為40g/L。杜勝利等研究了黃瓜離體雌核發(fā)育時的解剖特征和培養(yǎng)早期外植體的生理生化變化，結(jié)果表明，在子房培養(yǎng)前6d，外植體的各種酶都發(fā)生了與對照明顯不同的變化，解剖學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)此時雌核發(fā)育即已開始，培養(yǎng)24d胚狀體開始形成，40d形成成熟的胚狀體。在南瓜屬中，Met-wally等和陳學(xué)軍等利用未授粉胚珠培養(yǎng)，G6mesn6等利用未授粉子房培養(yǎng)均成功獲得了單倍體植株。同時Met-waUy等對4℃低溫預(yù)處理效果進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)植株再生頻率在未經(jīng)過低溫處理時最好。甜瓜子房培養(yǎng)的報道相對較少。G6mesne等曾對培養(yǎng)條件進(jìn)行過摸索，并得到了單倍體植株。Ficcadenti等采用了與G6mesne等相似的培養(yǎng)方法獲得了甜瓜的單倍體植株，最高胚發(fā)生頻率可達(dá)36.4％，再生植株中單倍體發(fā)生頻率為15.4％。

2．2 輻射花粉授粉誘導(dǎo)單倍體研究

Sauton等叫通過輻射花粉授粉結(jié)合胚胎拯救技術(shù)從甜瓜作物中成功地獲得了單倍體植株，隨后人們對基因型、輻射劑量等影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)的研究并將其應(yīng)用于其他瓜類作物，取得了很大成功。

2．2．1 培養(yǎng)基 在黃瓜和甜瓜作物單倍體育種中的胚拯救技術(shù)一般將輻射花粉授粉后2～3周的果實(shí)剖開，把種子接種到不添加任何激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，約10d后將肉眼可見的綠胚種子挑出，剝出綠胚接種在MS+6-BA 0.2mg/L培養(yǎng)基上生長。在以上培養(yǎng)基上雷春等的研究報道黃瓜單倍體產(chǎn)率最高可達(dá)2.7％，而張永兵等研究報道的厚皮甜瓜4810和薄皮甜瓜新富玉單倍體植株的誘導(dǎo)頻率分別為0.55％和0.63％。謝淼等對胚拯救的誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用E20A+IAA 0.01mg/L，芽伸長培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.05mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1mg/L+1.0g/L活性炭，其單倍體再生率最高為1.28％。

2．2．2 基因型的影響基因型對單倍體產(chǎn)生的影響因作物不同有些差異，F(xiàn)iccadenti等對甜瓜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同的正反交組合對單倍體的誘導(dǎo)有顯著影響。Faris等CDq用8種不同基因型的黃瓜進(jìn)行試驗(yàn)證明，同一劑量下的單倍體發(fā)生頻率與基因型無關(guān)。

2．2．3 輻射劑量對單倍體誘導(dǎo)的影響 Co⁶⁰產(chǎn)生的r射線是誘導(dǎo)瓜類作物單倍體輻射花粉的有效輻射源，輻射劑量的選擇是誘導(dǎo)單倍體的關(guān)鍵因素之一。實(shí)踐中大多以臨界劑量或半致死劑量作為適宜劑量。輻射劑量與作物的種類、輻射的器官和植株的生長狀態(tài)等有關(guān)。黃瓜選用的劑量以200～300 CY劑量輻射時單倍體的誘導(dǎo)率較高。西瓜的常用劑量也為200～300 Gy；甜瓜的輻射劑量較常用的是5002500GY”；南瓜的有效輻射劑量普遍較低，通常為25～50Gy。

2．2．4 其他因素的影響 親本植株良好的生長狀態(tài)直接影響到單倍體的發(fā)生頻率，因此適宜的溫濕環(huán)境對植株生長很重要。花粉管到達(dá)胚囊的數(shù)量越多，越能有效地促進(jìn)雌核發(fā)育，從而提高單倍體的誘導(dǎo)率，因此花粉在輻射前后生活力的保持和授粉量的多少也是影響誘導(dǎo)率的關(guān)鍵因素。此外，輻射花粉誘導(dǎo)雌核產(chǎn)生的胚大都不能發(fā)育完全，敗育胚的比例很高(正常發(fā)育者為二倍體)，可能與發(fā)育不全的胚乳營養(yǎng)供應(yīng)不足有關(guān)，因此適時進(jìn)行胚拯救極為重要，

3 瓜類作物單倍體植株加倍技術(shù)研究

在瓜類作物單倍體育種中的單倍體自然加倍率很低，僅在西瓜上有過報道，人為加倍技術(shù)一般借鑒傳統(tǒng)的西瓜、甜瓜整體誘導(dǎo)多倍體的方法一秋水仙堿浸泡法來處理單倍體植株，并無多大改進(jìn)，因此存在誘導(dǎo)頻率低、誘變植株發(fā)育不良、花期延遲、部分植株為嵌和體等缺點(diǎn)，離實(shí)際應(yīng)用還有一定的距離。目前，對于瓜類單倍體加倍的深入研究較少，并且僅局限在單倍體植株的離體加倍處理。Abak對黃瓜單倍體植株進(jìn)行離體加倍試驗(yàn)，具體作法是：取1個月左右的無菌苗在無菌狀態(tài)下用秋水仙堿浸泡后，用無菌水沖凈，轉(zhuǎn)入E20A培養(yǎng)基培養(yǎng)，被馴化后的小苗轉(zhuǎn)入蛭石中育苗，結(jié)果以0.5％秋水仙堿處理4h或1％秋水仙堿處理2h2個處理對黃瓜單倍體加倍均有效，但誘導(dǎo)成活率較低，僅為6％左右。Sad和Abak等采用0.5％秋水仙堿和以上方法也成功地使西瓜單倍體加倍得到雙單倍體植株，而用1％秋水仙堿浸泡西瓜單倍體幼苗生長點(diǎn)2～4h，卻未獲得雙單倍體植株，因此他們認(rèn)為，與黃瓜相比，西瓜對秋水仙堿的敏感程度較低。在加倍得到的西瓜雙單倍體植株有正常的葉片、生長勢和育性，自交能獲得種子。

4 倍性鑒定

4．1 染色體記數(shù)法

染色體計數(shù)法是確定倍性最基本和最精確的方法，通常以根尖為材料，也可選擇以卷須、葉片愈傷組織為材料，常采用壓片法和去壁低滲法進(jìn)行染色體標(biāo)本制備，其中后者是當(dāng)前植物染色體研究中的重要方法。該方法既可用于染色體計數(shù)，還可用于染色體組型分析Gimsa分帶等研究，并可借助掃描電鏡對植物染色體進(jìn)行觀察。

4．2 形態(tài)鑒定法

Sari等凹研究比較了2個西瓜品種二倍體及其單倍體植株的田間表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)單倍體植株的葉面積、莖長、莖粗顯著低于二倍體，單倍體植株的雌、雄花也明顯小于二倍體，單倍體雄花中沒有花粉粒，而二倍體則有。韓毅科、杜勝利等在進(jìn)行黃瓜單倍體鑒定時發(fā)現(xiàn)黃瓜單倍體一般葉片較小，植株長勢較弱，雄花敗育，其中單倍體雌雄花花冠明顯深裂，單倍體不能正常結(jié)籽，可作為區(qū)分黃瓜單倍體和二倍體植株的明顯形態(tài)標(biāo)志。

4．3 細(xì)胞學(xué)鑒定法

若進(jìn)行單倍體誘導(dǎo)、加倍研究，根據(jù)植株形態(tài)鑒定其倍性，時間較晚，因此必須借助細(xì)胞學(xué)手段進(jìn)行培養(yǎng)期的倍性鑒定，目前，染色體計數(shù)法是倍性鑒定最準(zhǔn)確、直接的鑒定方法，但染色體制片需要較高的細(xì)胞學(xué)水平，且費(fèi)時、費(fèi)力。Sari等在西瓜上、Norio、馬國斌等在甜瓜上發(fā)現(xiàn)葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體個數(shù)與植株倍性呈正相關(guān)，可作為鑒定西、甜瓜植株倍性快速、有效的方法，而在黃瓜上也存在這種相關(guān)性。Sari、zhang等在西瓜上利用流式細(xì)胞儀(now cytometry)測定細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量，可迅速確定細(xì)胞的倍性并進(jìn)一步鑒定植株的倍性。

5 存在的問題及展望

目前瓜類作物單倍體育種中的子房培養(yǎng)、胚搶救和花藥培養(yǎng)等均已獲得成功，并取得了可喜的進(jìn)展，但仍然存在誘導(dǎo)頻率低、重復(fù)性差等問題，因此離建立一套成熟的培養(yǎng)體系還有一定距離，瓜類作物的單倍體培養(yǎng)自然加倍率不高，這些植株必須經(jīng)過秋水仙堿等處理后才能變?yōu)槎扼w，有的甚至?xí)a(chǎn)生多倍體，這些研究者尚不能控制，因此單倍體加倍方法有待繼續(xù)探討。單倍體育種中是否出現(xiàn)理想的重組體是關(guān)鍵，后代株系間的分離類型、出現(xiàn)頻率、變異幅度是育種者關(guān)心的問題，現(xiàn)在尚未見有人對瓜類單倍體培養(yǎng)的后代變異進(jìn)行過研究。

自交系選育是現(xiàn)代雜交優(yōu)勢育種的關(guān)鍵，傳統(tǒng)的雜交和回交后代需經(jīng)多代自交，一般需要5～5代或更長時間才能純合，若用成熟的單倍體誘導(dǎo)及加倍技術(shù)僅需5～6個月，便可從優(yōu)良品種雜交和回交后代中獲得優(yōu)良純系，加速自交系的選育，獲得新的育種材料，縮短育種年限，從而提高瓜類作物新品種的選育速度。此外，離體培養(yǎng)直接得到純合株，有利和不利的隱性突變基因都可以得到表達(dá)，進(jìn)行離體誘變和抗性突變體篩選，可使選擇效率大大提高。總之，隨著瓜類單倍體技術(shù)的深入研究和應(yīng)用，它在育種材料的創(chuàng)新、新品種的培育上，將發(fā)揮更重要的作用。

作者簡介：李建欣，女，碩士，主要從事蔬菜育種與生物技術(shù)研究。