ＭＴＴ法和水溶性四氮唑（ＷＳＴ－１）法檢測中波紫外線照射ＨａＣａＴ細(xì)胞后活力的比較

[摘要]目的：觀察中波紫外線照射后HacaT細(xì)胞活力的變化并探討水溶性四氮唑(wsT一1)法檢測的適用性。方法：將HacaT細(xì)胞分為對照組(假照射組)、300J／m²、600J／m²、900J／m²紫外線照射后24h組(每組6個(gè)樣本)。600J／m²紫外線照射后4h組、8h組、12h組、24h組、48h組、72h組(每組6個(gè)樣本)。血球計(jì)數(shù)板計(jì)算HacaT細(xì)胞數(shù)量。四甲基偶氮唑鹽(MTT)法和水溶性四氮唑(wsT-1)法活性測定HacaT細(xì)胞活性。結(jié)果：MTT法顯示300J／m²、600J／m²、900J／m²紫外線照射HacaT細(xì)胞24h后光密度(OD)值明顯較OJ／m²組低；wsT-1法各組OD值明顯比0J／m²組低。MTT法顯示600J／m。紫外線照射HacaT細(xì)胞8h、12h、24h、48h、72h后0D值明顯比0J／m²組低。wsT-1法顯示600J／m²紫外線照射HacaT細(xì)胞4h后OD值較OJ／m。組低；600J／m²紫外線照射HacaT細(xì)胞8h、12h、24h、48h、72h后OD值明顯比0J／m²組低。wsT－1法的OD值與細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT法0D值呈正相關(guān)。結(jié)論：隨著紫外線劑量的加大和照射后時(shí)間延長，HacaT細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞的活力下降，wsT－1代謝活性亦降低，呈時(shí)間和劑量依賴性。HacaT細(xì)胞可對wST一1進(jìn)行代謝，適用于該細(xì)胞增殖研究。

[關(guān)鍵詞]MTT法；水溶性四氮唑(wsT－1)法；中波紫外線；HacaT細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]Q813．1+1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008—6455(2007)02－0162－04

傳統(tǒng)檢測細(xì)胞活力方法如MTT法，過程較復(fù)雜，而新的方法如水溶性四氮唑(WST-1)法較直接，但WST-1是否能對HaCaT細(xì)胞代謝，目前國內(nèi)未見報(bào)道，為了證實(shí)WST一1法可適用于檢測HaCaT細(xì)胞活力，本研究用MTT法和WST-1法檢測中波紫外線照射HaCaT細(xì)胞后的活力，并進(jìn)行比較，結(jié)果較滿意，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料和方法

1．1主要試劑：四甲基氮唑鹽(MTT)一Sigma：水溶性四氮唑(WST一1)試劑盒(Boehringer Mannheim公司)。

1．2細(xì)胞株：HaCaT細(xì)胞株(武漢細(xì)胞庫)。

1．3主要儀器：紫外線燈(上海長興機(jī)械廠，功率16W，波長為280～320hm，波峰值302nm)；紫外線強(qiáng)度檢測儀(上海寶山顧村電光儀器廠)；BCM-100型超凈工作臺(tái)(蘇州市蘇凈集團(tuán))。

1．4細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

1．4．1將HaCaT細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞數(shù)為2×104個(gè)／孔，待細(xì)胞長至50％～60％鋪滿瓶底時(shí)，以PBS液置換培養(yǎng)基，給予不同劑量紫外線照射，照射完成后換為培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。另6組給予600J／m。紫外線照射，照射完成后換為培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間。

1．4．2加0．2ml胰酶消化，同時(shí)加0．1ml全血清滅活后用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算。加D-Hanks液0．8ml和0．3％臺(tái)盼藍(lán)0．1ml后，用滴管取混合均勻的細(xì)胞懸液適量滴入血球計(jì)數(shù)板，于低倍鏡下計(jì)算四角四個(gè)大中格內(nèi)活細(xì)胞數(shù)(即透明未著色者)，按公式(四大中格細(xì)胞數(shù)／4)×10。=細(xì)胞數(shù)／m1計(jì)算(每一中格體積為O．1inm3)。

1．5 MTT法活性測定HaCaT細(xì)胞活性

1．5．1將HaCaT細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞長至50％～60％鋪滿瓶底時(shí)，以PBS液置換培養(yǎng)基，給予不同劑量紫外線照射，照射完成后換為培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。另6組給予600J／m²紫外線照射，照射完成后換為培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間。

1．5．2去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次后，加入100ul含有l(wèi)mg／mlMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，加二甲基亞砜溶解，振蕩15min(300rpm／rain)，酶標(biāo)儀490nm波長檢測光密度(OD)值，即MTT檢測值。

1、6 WST一1法活性測定HaCaT細(xì)胞活性：細(xì)胞培養(yǎng)同1．5．1。每孔加入即用型WST-1溶液10ul／孔，繼續(xù)置37℃ 5％C0₂細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育90min，取出培養(yǎng)板置振蕩器上充分振蕩(300rpm)lmin后在酶標(biāo)儀450／630nm雙波長檢測光密度(0D)值，即WST—l檢測值。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)一個(gè)空白對照組，對照孔吸光值應(yīng)<0．01。

1．7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：以SPSSll．5統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量資料以(x±s)表示；組間顯著性檢驗(yàn)用One-way Annova分析，方差齊性時(shí)用LSD(1east significant difference，LSD)檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Tamhane’s檢驗(yàn)；當(dāng)P≤0．05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1不同劑量紫外線照射對HaCaT細(xì)胞生長增殖和活性的影響：不同劑量紫外線照射HaCaT細(xì)胞24h后細(xì)胞計(jì)數(shù)，經(jīng)One-way Annova分析，F(xiàn)=26．462，P

不同劑量的紫外線照射HaCaT細(xì)胞后不同時(shí)間MTT法0D值經(jīng)One-way Annova分析，F(xiàn)=39．589，P

不同劑量的紫外線照射HaCaT細(xì)胞后不同時(shí)間WST-1法0D值經(jīng)One-way Annova分析，F(xiàn)=5a 865，P

細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT法和WST-1法OD值的關(guān)系：細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法OD值呈正相關(guān)(r=-O．776，P<0．001)。細(xì)胞計(jì)數(shù)和WST-J法OD值呈正相關(guān)(r=0．846，p＜001)。MTT法和WST-1法0D值呈正相關(guān)(r=0．825，P

2．2 600J／m²。紫外線照射HaCaT細(xì)胞后不同時(shí)間生長增殖和活性的變化

600J／m²紫外線照射HaCaT細(xì)胞不同時(shí)問細(xì)胞數(shù)經(jīng)One—way Annova分析，F(xiàn)=24．598，P

600J／m。紫外線照射HaCaT細(xì)胞后不同時(shí)間MTT法OD值經(jīng)One-way Annova分析，F(xiàn)=43．514，P<0．001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

600J／m²。紫外線照射HaCaT細(xì)胞后不同時(shí)間WST-1法0D值經(jīng)0ne-way Annova分析，F(xiàn)=37．707，P<0．001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT法和WST-1法OD值的關(guān)系：細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法0D值呈正相關(guān)(r=0．851，P

3討論

反映細(xì)胞增殖狀況的指標(biāo)有活細(xì)胞數(shù)量、DNA合成、細(xì)胞代謝活性和細(xì)胞周期等，其中最直接的指標(biāo)是活細(xì)胞數(shù)量的變化。但細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法操作繁瑣費(fèi)時(shí)，所需細(xì)胞量較多。四哇鹽一MTT，XTT(2，3-bis(2-mathoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)一5一(phenylaminocarbonyl)-2H-tetrazol iumhydroxide)及WST-1等因其可在活細(xì)胞中裂解成有色的甲月替產(chǎn)物(formazan)而被用于細(xì)胞代謝活性的檢測。與傳統(tǒng)的MTT(其裂解產(chǎn)物為難溶結(jié)晶體)法相比，XTT和WST-1能直接產(chǎn)生水溶性的有色產(chǎn)物，具有更加敏感、方便、省時(shí)(僅需0．5-4h)的優(yōu)點(diǎn)；而WST-1又比XTT穩(wěn)定，可作即用型試劑。國外學(xué)者采用WST-1方法定量測定培養(yǎng)細(xì)胞的活性與增殖能力，證實(shí)了其方法的可靠性和簡易性。WST-1的局限在于不能被所有細(xì)胞所代謝。本文研究結(jié)果表明，隨著紫外線照射劑量增高和照射后時(shí)間延長，HaCaT細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)量減少，其WST-1代謝活性亦降低，與MTT法呈正相關(guān)，說明HaCaT細(xì)胞可對WST-1進(jìn)行代謝，因此適用于該細(xì)胞增殖研究。

(注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。)