健脾補肺對Ｄ－半乳糖誘導小鼠皮膚衰老模型影響的實驗研究

[摘要]目的：觀察健脾補肺對抗皮膚衰老的作用。方法：建立小鼠D一半乳糖衰老模型，與維生素E比較，觀察健脾補肺4y(資生-湯)高、中、低三個劑量組對羥脯氨酸、透明質酸、皮膚蛋白和形態學的效應。結果：資生湯可以提高皮膚羥脯氨酸和皮膚蛋白的含量，改善皮膚衰老形態學。結論：健脾補肺對D－半乳糖所致小鼠衰老皮膚有對抗作用。

[關鍵詞]健脾補肺；資生湯；抗皮膚衰老；羥脯氨酸；透明質酸；形態學

[中圖分類g-]R289．5 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)02—0252—03

中醫理論認為肺主皮毛，主衛氣；脾主肌肉，化營氣；營衛又“熏膚充身澤毛”。皮膚是最早被觀察到的衰老器官，肺脾營衛可能與皮膚衰老狀況直接相關。我們選用中藥方資生湯，通過動物實驗觀察其健脾補肺、調理營衛對模型動物衰老皮膚的影響。

1材料和方法

1．1實驗動物：健康4月齡昆明種小鼠120只，雌雄兼用，購自北京大學醫學部實驗動物中心。各組小鼠在相同條件下，自由飲水、攝食，保持自然光照，實驗動物喂全價顆粒飼料(購自北京大學實驗動物飼料廠)。

1．2實驗藥物、模型建立及給藥方法：資生湯由人參、黃芪等組成，藥物購自北京中醫藥大學國醫堂，由本校藥學系中藥制備教研室加工、濃縮成4g／ml(每毫升含4g生藥)的浸膏，避光冷藏備用，灌胃時用生理鹽水配成所需濃度。以維生素E為陽性對照藥(購自北京市售藥店)，把120只4月齡昆明種小鼠雌雄分開，每組小鼠性別、體重均衡，隨機分為6組，每組20只，分別設為正常組、模型組、陽性對照組(簡稱陽性組)、資生湯高劑量組、中劑量組和低劑量組(分別簡稱資高、中和低組)，正常組常規進食飲水及光照。其他各組參照文獻按100mg／kg體重每天頸背部皮下注射D一半乳糖，每周禁食稱重一次。模型組每天灌服生理鹽水，陽性對照組每天灌服維生素E 50mg／kg，資生湯高、中、低劑量組按(生藥／體重)8g／kg、4g／kg、2g／kg灌胃，連續6周。

1．3取材方法：第7周處死動物前一天，所有動物兩肩胛至兩髂骨之間背部皮膚以10％Na~S溶液對稱脫毛，第2天用10％水合氯醛按3．5ml／kg體重腹腔注射麻醉，腹主動脈取全血放入肝素鈉管中，3 500轉／min，離心20min取上清液冷藏待測。剪下背部脫毛后的皮膚、鋪平，用直徑為1．4cm的打孔器對稱取下4塊皮膚，除去皮下脂肪后將其分別適當剪碎，同側2塊置EP管中，80℃冰箱凍存用于羥脯氨酸測定，另2塊制備成10％組織勻漿。另剪取頸部皮膚放入4％中性多聚甲醛溶液固定。

1．4指標測定：所用儀器有精密電子天平、Bi0680型酶標儀、勻漿機等。

1．4．1皮膚蛋白、羥脯氨酸(hydroproline，HPY)測量參照試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)說明書操作，用Bi0680酶標儀測定吸光度值(由北京中醫藥大學病理實驗室提供)。

1．4．2血清透明質酸(hyaluronic acid，HA)送至北京北方生物工程研究所放免檢測。

1．5皮膚組織學觀察：4％中性多聚甲醛溶液固定皮膚組織石蠟包埋、切片、脫蠟、脫水、HE染色，光學顯微鏡觀察。

1．6數據統計：統計后數據用x±s表示，進行方差齊性檢驗后用t檢驗進行多組均數的兩兩比較，方差不齊者用秩和檢驗。

2結果

2．1鼠血清透明質酸(HA)、皮膚蛋白及皮膚羥脯氨酸(HPY)比較：見表l～2。

模型建立后，小鼠皮膚蛋白降低，與其他各組相比有顯著統計學意義(P<0．05、P

2．2小鼠皮膚組織學觀察：見圖1～6。

正常組小鼠皮膚結構完整，表皮與真皮界線清晰，表皮較規則，真皮層較厚，染色較均勻，細胞層數較多；基底膜可見，皮下脂肪少；毛囊、皮脂腺可見(見圖1)。模型組小鼠皮膚結構紊亂，表皮與真皮界線尚可分，表皮欠規則；真皮顯著變薄，染色不均勻，細胞層數減少；基底膜不清晰，皮下脂肪豐富；毛囊、皮脂腺欠完整(見圖2)。陽性對照組小鼠皮膚結構尚清晰，皮膚比模型組略增厚，表皮與真皮界線可分，表皮規則；真皮變薄，染色較均勻，細胞層數減少；基底膜不清晰，皮下脂肪豐富；毛囊、皮脂腺可見(見圖3)。高劑量組小鼠皮膚結構完整，皮膚明顯增厚，表皮與真皮界線清晰，表皮規則，真皮層較厚，染色較正常組均勻致密，細胞層數增多；基底膜可見，皮下脂肪少；毛囊、皮脂腺完整(見圖4)。中劑量組小鼠皮膚結構完整，皮膚略增厚，表皮與真皮界線清晰，表皮較規則，真皮層較厚，染色較均勻，細胞層數增多；基底膜可見，皮下脂肪少；毛囊、皮脂腺完整(見圖5)。低劑量組小鼠皮膚結構基本恢復，表皮與真皮界線清晰、規則，染色較均勻，細胞層數增多；基底膜可見，皮下脂肪少；毛囊、皮脂腺可見(見圖6)。

3討論

正常人皮膚潤澤，富有彈性，少有皺紋。衰老時則變得粗糙，缺乏光澤和彈性，皺紋增多。《黃帝內經》已經認識到人體很早就開始衰老的事實。在《素問·上古天真論》中記載“女子…五七，陽明脈衰，面始焦，發始墮…。男子…六八，陽氣衰竭于上，面焦，發鬢斑白…”。陽明，胃合大腸，與脾和肺相互表里。陽明脈衰，源于脾失運化，肺失主氣。婦女五七，即35歲左右開始面部皮膚出現變化，即“焦”，就是失去光澤，缺乏彈性，皺紋增加等衰老表象，這與實際觀察是一致的。男子六八，即48歲左右，此處用了“面焦”一詞，說明已經完全形成衰老表型，其原因為“陽氣衰竭于上”，陽氣，有先天和后天之分，先天之陽秉于父母，后天陽氣則賴脾胃運化水谷精微，肺主氣來充養協調。因此，從人體出現衰老表象之始，通過健脾補肺，調理營衛，能夠起到改善皮膚衰老的目的。由此，我們選用D一半乳糖亞急性衰老模型，以期更接近早期衰老狀態，檢驗健脾補肺對衰老表型的影響。

皮膚中富含膠原蛋白，隨著年齡增長，膠原蛋白可出現交聯、老化，皮膚僵硬度增加而缺少彈性，代謝率降低，皮膚膠原產物減少。這與中醫脾失運化，肺失主氣，營衛失調的理論認識相一致，所以測量膠原蛋白的變化可能反映皮膚衰老的狀況。羥脯氨酸是膠原蛋白特有的氨基酸之一，約占膠原蛋白全部氨基酸殘基的13．4％。衰老時羥脯氨酸含量降低，故測定皮膚中羥脯氨含量變化可作為判定受試動物皮膚衰老程度的一個特殊而敏感的指標。在本實驗中，模型建立后，小鼠皮膚總蛋白含量降低，與其他各組相比有顯著統計學意義(P<0．05、P

綜上所述，資生湯通過健脾補肺可促進皮膚蛋白合成，提高皮膚羥脯氨酸水平，促進膠原合成，改善和恢復衰老皮膚外觀，具有一定的抗皮膚衰老的作用。根據資料，資生湯上述生化效果產生的機制可能與其各組中成藥均有清除自由基、促進細胞代謝，提高免疫力等藥理作用相關。

編輯／李陽利

(注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。)