體外培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究

[摘要]目的：了解體外培養(yǎng)的人脂肪問充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及其體外成脂和成骨的能力。方法：體外培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞并傳代計(jì)數(shù)，行成骨和成脂誘導(dǎo)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞增殖周期與表面分子。結(jié)果：人脂肪干細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)均一的陽性表達(dá)CD44、CDl06，而CD49d、CD34、CD45和HLA—DR表達(dá)陰性。細(xì)胞周期分析表明：G₀／G₁、s和G₂／M所占比例分別為79．1％、19．7％和1．3％。分離細(xì)胞在誘導(dǎo)體系下可以向成骨和戍脂方向分化。結(jié)論：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有特殊的生物學(xué)特點(diǎn)，體外能夠向成骨和成脂方向分化。

[關(guān)鍵詞]脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；分化；脂肪細(xì)胞；成骨細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]Q813．1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008—64 55(2007)02—0159－03

間充質(zhì)干細(xì)胞最初由Friedensrein等Ⅲ發(fā)現(xiàn)，其廣泛分布于肌肉、血管、胰腺和脂肪等組織中，而且證實(shí)在體外可以分化為成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞。其中脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便，痛苦小，在細(xì)胞治療和組織工程方面有廣闊的前景因而日益引起研究者的重視。本研究通過分離脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，研究其生物學(xué)特性及體外成脂及成骨的能力，為其作為組織工程的種子細(xì)胞提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1．1材料與試劑

1．1．1細(xì)胞培養(yǎng)體系：MEM培養(yǎng)基(GIBC0)，10％胎牛血清(蘭州明海生物公司)，100IU／L青、鏈霉素。

1．1．2細(xì)胞表面分子鑒定相關(guān)試劑：CD44、CD49d、CD34、CD45、CDl06和HLA-DR(鼠抗人cALTAG)FITC(羊抗鼠ZYMED)

1．1．3細(xì)胞周期測(cè)定相關(guān)試劑：R Nase A(TakaRa)、碘化丙啶(PI，Sigma)。

1．1．4其他試劑：胰酶、地塞米松、β－甘油磷酸鈉、維生素C、胰島素、卜甲基3－異丁基一黃嘌呤、吲哚美辛、膠原酶I(sigma)。

1．2方法

1．2．1脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化與培養(yǎng)：脂肪組織來源于蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院美容中心行脂肪抽吸術(shù)的患者，身體健康，無任何疾病。無菌條件下，在局部腫脹麻醉下采用注射器法抽取50ml顆粒脂肪組織，靜置30min，去除上清液體，獲得純度較高的脂肪顆粒，用等容的D—Hank’s平衡鹽液清洗4次，去除細(xì)胞碎片。然后用150ml HBSS(含0．075％膠原酶I)，在37℃，振動(dòng)消化lh。膠原酶I的活性用等量的MEM(含10％的胎牛血清)中和之后離心1200r，lOmin。細(xì)胞被懸浮在MEM(含10％的胎牛血清)用100目篩網(wǎng)過濾。離心后，細(xì)胞重懸于MEM培養(yǎng)液，添加至培養(yǎng)皿，37℃，C0₂孵箱中培養(yǎng)24h，未貼壁的細(xì)胞和殘?jiān)怀簦砑有迈r培養(yǎng)液于貼壁細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)至80％融合時(shí)，用胰酶／EDTA消化和按1：1的比例傳代。

1．2．2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞接種后每次換液時(shí)用相差顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞生長與形態(tài)變化，并分別于細(xì)胞接種后24h、10天、2周時(shí)攝相記錄。在培養(yǎng)皿里加入蓋玻片，待細(xì)胞爬滿后經(jīng)過PBS清洗后，固定行油紅0染色。

1．2．3細(xì)胞表面分子測(cè)定：取傳第二代以后的細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)，操作步驟如下：

培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞經(jīng)過消化離心(1000r／min，5min)后細(xì)胞重懸；細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞濃度調(diào)整為l×10⁸／L，分別于人抗CD34、CD44、CD45、CEl06、CD49d和HLA-DR單克隆抗體室溫反應(yīng)30min，PBS洗滌2次后于FITC標(biāo)記的二抗避光作用30min。用PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1．2．4細(xì)胞周期的測(cè)定：培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞經(jīng)過消化離心(1000 r／min，5min)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁸／L，用70％的冰乙醇固定24h，RNase A處理30min，PI染色lOmin。用Cellquest軟件獲取10000個(gè)細(xì)胞，ModiFit分析細(xì)胞周期。

1．2．5細(xì)胞的油紅0染色：先將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液倒掉，并用PBS洗1～2遍，然后加入10％福爾馬林固定30min以上，倒固定液，用60％異丙醇浸泡30min，換油紅O染液1h，倒染液，60％異丙醇涮洗1次(5s)，自來水沖洗2～3min，換福爾馬林觀察并照相保存。

1．2．6脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)：取傳2代細(xì)胞，以l×10⁸／cm²的濃度接種與2個(gè)6孔板中。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)80％匯合時(shí)，每孔加入等量的成骨誘導(dǎo)試劑：含地塞米松(10-7mol／L)、B一甘油磷酸鈉(10mmol／L)、維生素C(50mg/L)，放入C0₂孵箱培養(yǎng)，2～3天換液。分別于細(xì)胞培養(yǎng)1、2周時(shí)吸出每組培養(yǎng)液，PBS洗2次，消化并離心，用MEM重懸細(xì)胞，然后離心涂片，行ALP染色。

1．2．7脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)：取傳2代細(xì)胞，以l×10⁸／cm²的濃度接種與2個(gè)6孔板中。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)80％匯合時(shí)，每孔加入等量的成脂誘導(dǎo)試劑：含lmol／L地塞米松、lOtxg／ml胰島素，0．5mmol／L 1一甲基3一異丁基一黃嘌呤，1001xmol／1吲哚美辛。對(duì)照組加常規(guī)培養(yǎng)液。每3～4天換液。3周后行油紅O染色。

2結(jié)果

2．1倒置相差顯微鏡觀察：接種后24h，極少數(shù)細(xì)胞貼壁，呈梭形，4天后細(xì)胞呈纖維集落樣生長，大約10天，細(xì)胞迅速生長并形成克隆，2周左右細(xì)胞近80％～90％匯合，出現(xiàn)致密的貼壁層。繼續(xù)培養(yǎng)，可見有自發(fā)分化的現(xiàn)象出現(xiàn)不典型的聚集的小脂泡。油紅0染色證實(shí)為脂肪，見圖l。分別為接種后24h，4天，2周，自發(fā)成脂分化的細(xì)胞。

2．2脂肪問充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原分子測(cè)定：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞均．的表達(dá)CD44，CDl06陽性，而CD34，CD45、CD49d和HLA—DR呈陰性表達(dá)。CD49d和CDl06是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的很好的區(qū)分標(biāo)記，見圖2。

2．3脂肪問充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞增殖周期：取3代細(xì)胞經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析表明：G₀。／G₁、s、G₂／M的細(xì)胞所占的比例為79．1％、19．7％、1．3％。結(jié)果顯示：我們分離培養(yǎng)的細(xì)胞處于G₀／G₁期，僅少數(shù)細(xì)胞處于活躍的增殖期，

2．4細(xì)胞ALP染色：第3代細(xì)胞在體外進(jìn)行成骨誘導(dǎo)時(shí)ALP陽性率較未誘導(dǎo)組明顯提高，見圖3。說明干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)體系下向成骨細(xì)胞分化。

2．5細(xì)胞的油紅0染色：第3代細(xì)胞在體外進(jìn)行成脂誘導(dǎo)時(shí)陽性率較未誘導(dǎo)組明顯提高，見圖4。說明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)體系下向脂肪細(xì)胞分化。

3討論

近年來骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是研究的熱點(diǎn)，考慮到脂肪組織和骨髓同為中胚層起源的組織，是否具有多向分化潛能，在實(shí)驗(yàn)中我們使用從脂肪抽吸術(shù)中獲取的脂肪顆粒，而沒有像其他文獻(xiàn)中使用腹部或取深層脂肪，其方法簡(jiǎn)單，減輕供者的痛苦，并且腫脹麻醉使用的利多卡因和腎上腺素經(jīng)過洗滌可除去，不會(huì)對(duì)其生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方法中，為排除紅細(xì)胞的干擾，常使用NH4CL破壞紅細(xì)胞。鑒于紅細(xì)胞不貼壁的特性，我們通過換液的方法去除紅細(xì)胞，取得很好的效果，2次換液后，紅細(xì)胞基本消失，而且減輕了NH4CL對(duì)脂肪干細(xì)胞的損傷。

眾所周知，骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞無特異的表面標(biāo)志，而De Ugarte等在一個(gè)病人身上分別取骨髓和脂肪組織，并對(duì)二者進(jìn)行了比較，初步證明在生長方式、多向分化潛能和細(xì)胞表面標(biāo)記無顯著的差異。本研究測(cè)定CD34、CD45、CD49d和HLA-DR陰性，CD44、CDl06陽性。CD49d和CDl06是脂肪問充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的很好的區(qū)分標(biāo)記。HLA-DR是成纖維細(xì)胞的表面標(biāo)記，CD34、CD45是造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記，通過它們我們可以認(rèn)為培養(yǎng)細(xì)胞為排除了成纖維細(xì)胞的干細(xì)胞，HLA-DR陰性也可以為脂肪問充質(zhì)干細(xì)胞的自體或同種異體移植提供理論依據(jù)。

細(xì)胞周期檢測(cè)顯示貼壁細(xì)胞中的G₀／G₁、S、G₂／M的細(xì)胞所占的比例為79．1％、19．7％和1．3％。說明絕大部分細(xì)胞處于靜止態(tài)，但保留自我更新和增殖能力，少部分處于功能態(tài)，這符合干細(xì)胞的特性，該結(jié)果也支持培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞為問充質(zhì)干細(xì)胞。本研究分別使用了誘導(dǎo)劑使其向成骨和成脂方向分化。地塞米松作為兩者的誘導(dǎo)劑，它依賴于使用劑量和作用時(shí)間的差異，在低濃度時(shí)表達(dá)為成骨細(xì)胞，而高濃度時(shí)則與胰島素共同作用激活糖皮質(zhì)激素受體，繼而啟動(dòng)PPARr，在轉(zhuǎn)錄水平激活脂肪細(xì)胞基因使其分化為脂肪細(xì)胞。由此推測(cè)成骨和成脂之間是否有某種關(guān)聯(lián)，值得進(jìn)一步研究。另外本研究還發(fā)現(xiàn)在無血清和低血清的條件下，誘導(dǎo)明顯好于10％胎牛血清，但增殖速度明顯減慢。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與其它干細(xì)胞相比，具有顯著的優(yōu)越性，它容易獲取，對(duì)患者的痛苦小，并且在脂肪抽吸術(shù)中獲取脂肪還可以達(dá)到變廢為寶的目的。其次這種細(xì)胞在體外增殖快，平均倍增時(shí)間為16h，不必進(jìn)行永生化就能獲取足夠的細(xì)胞進(jìn)行移植。人來源的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能夠進(jìn)行自體移植，可以克服免疫排斥。因此有望成為脂肪組織工程和基因治療的一種很好的細(xì)胞來源。

編輯／張惠娟

(注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文。)