Ｐ物質緩釋系統對正畸大鼠牙周破骨細胞數目的影響

[摘要]目的：探討P物質納米緩釋微球的生物活性及對正畸牙周改建中破骨細胞數目變化的影響。方法：將P物質一聚乳酸一聚乙醇酸共聚物納米緩釋微球(sP—PLGA NP)注射入正畸大鼠第一磨牙根尖水平齦下，分別在加力后1，3，7，14天后采用HE染色觀察牙周組織變化和壓力側破骨細胞數目，并和單純用P物質以及空白對照組比較。結果：加力后1天，三組間牙周都未發現有破骨細胞；加后3天，破骨細胞數量表現為P物質組>緩釋納米微球組>對照組，與對照組有顯著性差異(P<0．05)；加力后7天，表現為緩釋納米微球組>P物質組>對照組，與對照組有顯著性差異(P<0．05)；加力14天后，三組破骨細胞數量都有減少，但緩釋納米微球細數量最多。結論：P物質能促進嘶中牙周破骨細胞形戍，而sP—PLGA NP能在較長時間維持這種作用。

[關鍵詞]P物質；聚乳酸一聚乙醇酸共聚物；納米微球；破骨細胞；牙齒移動

[中圖分類號]R813．1．1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)02-0153-03

P物質在正畸組織改建中發揮重要的作用，但其在體內半衰期短，很快會被機體降解，不利于觀察它的作用。為了能在動物體內較長時間觀察P物質的作用，我們選擇聚乳酸一聚乙醇酸共聚物(poly lactide—co-glyc01ide，PLGA)為載體材料，應用復乳干燥法制備了P物質納米微球。本試驗采用給正畸大鼠注射P物質緩釋納米微球，并與單純使用P物質以及空白對照組比較，觀察P物質納米緩釋微球的生物活性情況以及對牙周壓力側破骨細胞數目的影響。

1材料和方法

1．1實驗動物及分組：6周齡SD雄性大鼠48只，體重：(180±20)g，解放軍第四軍醫大學實驗動物中心提供。分籠飼養，自由攝食、飲水，飼料為本校實驗動物中心提供的普通塊料。避光靜養48h后進行實驗。第l組：加力后立即在第一磨牙根尖水平牙齦下注射含5×10—3rng P物質的sP—PLGA NP的PBS溶液100ul(緩釋納米微球組)；第2組：加力后立即在第一磨牙根尖水平牙齦下注射含5×10^-1mgP物質的PBs 100ul(P物質組)；第3組：加力后立即在第一磨牙根尖水平牙齦下注射100ul的PBs(對照組)。每一組中分四個亞組：加力l天組、3天組、7天組、14天組。每一亞組4只大鼠。1．2主要試劑與儀器：人P物質(substance P)(Sigma公司，USA)；自制P物質納米粒及其凍干粉劑(圖1)；速眠新(長春軍需大學獸醫研究所)；細金剛砂鉆(登士柏公司)；正畸測力計(精確到1g，Swi ss)；正畸用螺旋彈簧(杭州新亞公司)；OLYMPUS數字顯微鏡(JaparO；JEM-2000EX透射電鏡qaparO。1．3動物模型及標本制備：SD雄性大鼠，體重(180±20)g(7～9周)。加力裝置采用結扎絲將一根鎳鈦螺旋拉簧一端扎在上頜第一磨牙上，另一端結扎在上頜中切牙上，并用自凝塑料加固結扎絲與牙連接處。加力值為50g，使磨牙向近中移動。分別在各組時間點將各亞組大鼠處死取材：速眠新深麻，開胸經左心室插管至升主動脈進行灌注固定，先用80～lOOml生理鹽水將血管內的血液沖洗干凈，再注入含4％多聚甲醛的固定液400ml灌流內固定1．5h，由口腔內切開上頜骨周圍軟組織，剪斷雙側顴突，取出上頜骨，修剪后置于4％多聚甲醛液中固定4天，然后置于由甲醛、甲酸和鹽酸組成的脫鈣液中脫鈣10天。將脫鈣的上頜骨去除多余組織，保留磨牙，入30％蔗糖24h 4℃至組織沉底。常規石蠟包埋后，沿近遠中方向縱行切片，片厚5um。1．4 HE染色，觀察結果：切片進行HE染色：蘇木素浸染lOmin，清水沖洗，入鹽酸1s，沖洗，稀氨水30s，沖洗，伊紅lmin，75％～100％梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每個標本取包含根尖周的切片二三張，每張切片在×40顯微鏡下觀察壓力側牙周近根尖處組織，計數單個視野內破骨細胞數量(三核以上為納入標準)。

1．5統計學處理：測量所得數據以x±s表示，結果用SPSS 11．0作統計學分析。多組均數問差異性比較用方差分析(F檢驗)，三組問兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0．05為差異有顯著性。

2結果

2．1P物質納米球膠體溶液混懸透明。在電鏡下，該納米球表面光滑圓整，球體均勻度好，粒徑分布較均勻，平均粒徑(22．32±5．41)nm，見圖l。凍干粉劑為白色疏松粉末，無塌陷或萎縮現象。4℃下放置3個月后，凍干粉再分散性良好，在生理鹽水中均勻分布呈乳狀液，無沉淀，表明納米粒穩定性及再分散性良好。P物質納米球的載藥量為(32．08±1．67)×10。。(g／g)，包封率為(66．28±3。56)％。該納米微球在12天內能夠一直持續釋放P物質，突釋期內P物質釋放度為25．64％，12天后釋放度為77．46％。2．2組織切片顯示：加力后1天，壓力側牙周間隙縮窄，牙周膜中有形成份減少，可見無細胞區的玻璃樣變，未見破骨細胞；加力3天后，壓力側牙周組織玻璃樣變性區增大，牙周膜纖維開始出現破壞，鄰近的骨吸收陷窩增大，增深，可見有破骨細胞(圖2)；加力7天后壓力側透明樣變性區縮小，牙槽骨呈鋸齒狀吸收陷窩，內可見較多的破骨細胞(圖3)；加力14天后壓力側牙槽骨吸收仍然明顯，骨表面陷窩內有破骨細胞存在，但“鋸齒”顯著變小(圖4)。加力后1天，三組間牙周都未發現有破骨細胞；加力后3天，破骨細胞數量明顯增加，并且P物質組>緩釋納米微球組>對照組(P<0．05)；加力后7天，破骨細胞數量繼續增多，緩釋納米微球組>P物質組>對照組(P<0．05)；加力14天后，三組破骨細胞數量都有減少，但緩釋納米微球組數量最多，多于其它兩組，但均和對照組問則無統計學差異。該結果提示我們所制備的SP-PLGA NP能緩慢釋放活性物質，同時也表明P物質能促進局部破骨細胞形成。

3討論

P物質是一種由11個氨基酸組成的多肽易被酶水解，在體內半衰期僅有幾分鐘，導致其局部或全身應用的生物利用度低。為此，本研究制備了P物質納米微粒，能夠持續釋放P物質，并維持在有效生理濃度內，以利于在較長時間觀察它的作用。我們是以PLGA為載體材料，采用了單因素正交設計優化P物質納米微粒制備工藝。應用PLGA包封P物質，既可以起到緩釋作用，又可以利用材料的疏水性保護因子活性。PLGA是PLA(聚乳酸)和PGA(聚乙醇酸)的共聚物。由于其具有易于合成、質量穩定，生物惰性、生物可降解性、降解速度可調節性和良好的可塑性等優點，近些年來被大量用作控釋系統的骨架材料。實驗證明PLGA具有良好的生物相容性，不會引起明顯炎性反應、免疫反應和細胞毒性反應。PLGA也是美國FDA批準最早的可用于人體的高分子載藥材料。目前對于親水性藥物以PLGA為載體制備載藥微球一般用復乳溶劑揮發法。復乳法主要用于親水性藥物，例如蛋白質、疫苗等。P物質易溶于水，溶解度為lmg／m1。所以我們在選擇制備方法時，采用了復乳法。所制備的SP—PLGA納米微球球體均勻度好，凍干粉為白色疏松粉末，再分散性良好。

P物質在骨質改建中具有促進骨吸收的功效。Goto等通過大鼠顱骨實驗研究發現，極微量的sP就可使顱骨的骨吸收增加。此外，在培養的家兔破骨細胞中加入sP可使破骨細胞內的鈣離子濃度增加，從而使破骨細胞的骨吸收活動增加。這種現象可被SP受體的阻斷劑所阻斷。這些試驗表明SP可加速破骨細胞的骨吸收及促進骨的重建。交感神經切除后可引起局部SP釋放增加、破骨細胞數量增多及骨吸收表面積擴大。Goto等進一步研究表明，NKl受體廣泛分布于破骨細胞的胞膜及胞漿中，而在成骨細胞和其他骨細胞中較少，雖然尚沒有直接證據表明SP具有刺激骨吸收的作用，但SP可能通過NKl來調節破骨細胞的骨吸收作用。

sP樣神經纖維與正畸牙周組織的改建關系密切。Davidovitch等觀察了在貓上頜尖牙向遠中傾斜移動過程中的P物質反應，發現加力后1hP物質免疫反應就開始增強，尤其在張力區，這種染色增加的現象一直持續到12h，但到24h，其染色密度下降到對照組水平，且一直持續到14天。Norevall等觀察了大鼠上頜第一磨牙向頰側移動過程中的P物質反應，該實驗不僅觀察了加力階段而且還包括撤力后牙周組織修復階段。發現加力后24h或3天，P物質免疫反應明顯增強；撤力后14天P物質免疫反應仍然很強；撤力后28天P物質免疫染色強度開始下降，但仍明顯高于對照組。有學者推測在正畸牙齒移動過程中，機械刺激導致感覺神經末梢向牙周組織內釋放神經介質SP、降鈣素基因相關肽等，進一步激活牙周靶細胞(包括成骨細胞、破骨細胞、牙周膜成纖維細胞等)，從而影響這些細胞的生理功能，參與牙周組織的改建。

本研究發現：加力后1天，三組問牙周都未發現有破骨細胞；加力后3天，破骨細胞數量表現為P物質組>緩釋納米微球組>對照組；加力后7天，表現為緩釋納米微球組>P物質組>對照組；加力14天后，三組破骨細胞數量都有減少，但緩釋納米微球組數量最多，多于其他兩組，P物質組和對照組則無統計學差別，但P物質組絕對值要高于對照組。該結果證明了我們所制備的SP-PLGA NP能緩慢釋放活性P物質，同時也表明P物質能促進正畸牙周局部破骨細胞形成。結果也提示SP～PLGA NP可能在加速正畸骨改建中發揮作用，并需要進一步的研究證實。

編輯／張惠娟

(注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。)