不同方法分離的大鼠骨髓間充質干細胞增殖活性和成脂分化能力的比較

肖 斌

[摘要]目的：通過比較密度梯度離心和貼壁篩選兩種方法所獲MSCs的增殖活性和成脂分化能力，探索MSCs體外分離和純化的較好方法。方法：應用密度梯度離心和貼壁篩選兩種方法分離純化骨髓MSCs，并通過MTT法檢測其增殖活性，用第三代MSCs進行成脂誘導，以觀察兩種方法所獲MSCs的成脂分化能力。結果：密度梯度離心法所獲MSCs純度高，呈紡綞形或小三角形，增殖快，約7～10天融合：貼壁篩選法分離的原代細胞中紅細胞。破骨細胞等雜質細胞較多，增殖速度相對較慢，且經數次傳代仍有較多雜質細胞存在，經成脂誘導后，兩種方法所獲MSCs表現出相似的成脂能力，油紅O染色細胞計數值與光密度值比較兩組無顯著差異(P值>0．05)。結論：密度梯度離心法是體外分離和純化MSCs較好的方法，所獲細胞增殖活性高，與貼壁篩選法所獲MSCs具有相似的成脂分化能力。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞；細胞培養；成脂分化；組織工程

[中圖分類號]Q2－06 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)01－0021－04

骨髓間充質干細胞(mesenchy mal stem cell，MSCs)具有來源廣泛，容易獲取，創傷小，無免疫排斥反應，細胞處于未分化狀態，增殖能力強，易于培養和自體移植，不存在倫理、道德和法律爭議問題，克服了胚胎干細胞的弊端，其所具有的獨特優勢在組織工程研究中具有廣闊的應用前景。MSCs可以直接從自體骨髓腔抽吸或松質骨獲得，可作為組織工程中構建組織的種子細胞。MSCs常用的分離方法有貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法。由于流式細胞儀分選法步驟比較繁瑣，現在分離MSCs最常用的方法是貼壁篩選法和密度梯度離心法。本研究采用密度梯度離心法和貼壁法分離MSCs，并進行體外培養，通過比較所獲得MSCs的細胞純度、增殖活力及成脂能力，以尋求一種較為理想的體外分離、純化與培養MSCs的方法。

1 材料和方法

1．1材料：實驗動物為體重(100+20)g的2月齡雄性SD大鼠(蘭州軍區蘭州總醫院實驗動物科)。MEM(Gibco BRL公司)，胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，IBMX(Sigma公司)，CO₂恒溫培養箱(Heracell，德國)，超凈工作臺(杭州凈化有限公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司)。

1．2方法

1．2．1大鼠MSCs的分離、純化1．2．1．1貼壁法：將SD大鼠拉頸處死，75％酒精浸泡15～20min，無菌條件下取脛骨和股骨，將其兩端干骺端切除，顯露骨髓腔，用含10％FBS的MEM徹底沖洗骨髓腔，無菌注射器反復吹打沖出的骨髓，使骨髓細胞充分分散制成單細胞懸液，細胞計數，調整細胞密度，按2×10⁹／cm²密度置于培養皿中，37℃、5％CO₂培養箱中培養。

1．2．1．2密度梯度離心法：取骨髓方法同上，將所獲骨髓單細胞懸液800×g離心5min，去除上部的脂肪層，將余下部分加入含有1．073g/ml的percoll分離液中2500×g離心25mim；吸取中間層的單個核細胞，用培養基MEM洗滌2次，重新懸起細胞，細胞計數，調整細胞密度后，按2×10⁹／cm²，置于培養皿中，37℃、5％CO₂培養箱中培養。

1．2．2細胞傳代：細胞長至70％～80％融合時，以0．25％的胰蛋白酶消化，1×105／cm2密度進行接種。1．2。3增殖特性：取第1代細胞培養，經0．25％胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，按1×10⁵細胞／孔接種于96孔板。從接種后第1天起分別于第1．3．5．7．9．11天取6個時間點用MTT法檢測細胞增殖活性。用酶標儀在630nm波長下檢測每孔的光吸收值(OD)，并繪制生長曲線。

1．2．4定向誘導大鼠MSCs向脂肪細胞分化：細胞接近完全融合后，加入含1μmol／L的地塞米松，0．5mmol／L的IBMX，1μmol／ml的人胰島素，1μmol／ml吲哚美辛，10％FBS的MEM(誘導培養液)培養3～4天換液。

1．2．5特異性脂肪細胞染色鑒定：爬片細胞用PBS沖洗2遍，10％福爾馬林固定30 min，60％異丙醇固定30min，油紅O染液1h，60％異丙醇固定30min，蒸餾水沖洗棄液，顯微鏡下觀察拍照，隨機記數10個非重復視野內脂肪細胞占總細胞數的比例。

1．2．6油紅O染色定量：將P3代長至接近完全融合后加入含脂肪誘導劑的培養液，第14天油紅O染色(方法同上)后用蒸餾水沖洗后吹干，各培養皿加入同等量的異丙醇，充分震蕩搖勻后，將液體離心取上清放入比色杯中進行光吸收值測定，通過光密度值推斷脂肪細胞的數量。

1．2．7數據統計：所有數據均用x±s表示。使用SPSS11．0統計軟件對數據進行分析。兩組(密度梯度法組與貼壁法組)之間的比較用t檢驗，P值＜0．05為有統計學意義。

2 結果

2．1原代和傳代培養的大鼠MSCs的形態學觀察

2．2．1貼壁法所獲得的原代MSCs：于細胞生長至第3天可見貼壁細胞形態各異，并夾雜大量的紅細胞：經第一次換液后，細胞增殖加快，其增殖速度明顯快于密度梯度離心法。約第6天細胞達70％～80％融合，并形成多種細胞形態的增殖集落。細胞以多角和長梭形為主，并有較多的細胞呈圓形及其它不規則形態，并帶有樹枝狀突起，其間也可見許多紅細胞以及形體較大、含有多個核的破骨樣和巨嗜細胞樣細胞。經2～3次傳代后細胞以長梭形和三角形的為主(見圖1)。

2．2．2密度梯度離心法所獲原代MSCs：于細胞生長第3天時，可見許多貼壁細胞，并均勻分散生長；細胞以小三角形、梭形貼壁生長，胞核位于中央，其間夾雜少量有核的淋巴細胞，紅細胞極少見。第一次換液培養后，細胞增殖迅速，圓形貼壁細胞的數量明顯減少，梭形細胞的分裂速度明顯較快，在數量上占據優勢，培養5～7天后，培養細胞開始迅速增殖，細胞形態開始出現較大變化，可見紡綞形和星形多突起的細胞貼壁生長。10～14天時，細胞已達到70％～80％融合，進行傳代。傳代后的細胞增殖活力強，形成均一的長梭形、多角形細胞，一般培養5～8天，培養細胞達到70％～80％融合，再次進行傳代(見圖2)。

2．3 MSCs的生長曲線：兩組細胞MTT檢測顯示：密度梯度離心法所獲骨髓間充質干細胞子第1天OD值較高：從第3天起細胞迅速增殖，進入指數增長期；第7天起增殖速度明顯減慢，進入平臺期；而貼壁法所獲骨髓間充質干細胞第1天OD值明顯低于密度梯度離心法：細胞從第3天起增殖加快，進入指數增長期，增殖速度低于前一組：至第9天，細胞增殖明顯減慢進入下臺期(見圖3)

2．4大鼠MSCs定向誘導脂肪細胞：兩種方法所分離的細胞加入誘導培養液后，第3天在相差顯微鏡下可觀察到細胞胞質內有高折光性的小脂滴出現主要集中于細胞核周圍，隨著誘導時間的延長細胞內脂滴逐漸增多，胞內小脂滴逐漸聚集成大脂滴，細胞體積逐漸增大由原來的長梭形變為圓形或多角形，脂肪細胞中含大小不等的脂肪滴，脂滴被染成橙紅色證實誘導成脂肪細胞，而未誘導的對照組細胞則表現為陰性(見圖4、5)。每組隨機選取5枚蓋玻片，對兩種方法所獲骨髓間充質干細胞做油紅O染色后的脂肪細胞計數比較，結果密度梯度離心法和貼壁法的均值分別為(62．73±2．92)和(59．63±4．53)，經t檢驗顯示兩組細胞之間無顯著差異(P=1．39＞>0．05)。

2．5油紅O染色定量試驗：對兩種方法所獲骨髓間充質干細胞做油紅O染色光密度值測定比較，結果密度梯度離心法和貼壁法的均值分別為(0．28±0．14)和(1．01±0．99)，經t檢驗顯示兩組之間無顯著差異(P=0．191＞0．05)。

3 討論

1986年Friedenstein等首次報道，骨髓標本中的小部分貼壁細胞在培養過程中能夠分化成骨細胞，成軟骨細胞，脂肪細胞和成肌細胞，而且這些細胞經過20～30個培養周期仍能保持其多向分化潛能，這類細胞被稱之為MSCs。

MSCs內存在有幾套可以向幾種終未細胞分化的儲備基因，當某種因素在一定條件下對它進行作用時，就會誘導相應系列基因的表達，使細胞向這一方向分化。不同的研究者根據各自的結果，提出了不同的假說，伴隨著人們對MSCs更深入的研究與認識，MSCs的多向分化機制會逐漸被人們所了解。Lee等證實MSCs是脂肪移植較好的細胞來源。MSCs具有多向分化潛能，易誘導為成熟細胞，來源豐富，可塑性強等特點。最大特色是可實現個體化治療，可以冷凍保存，方便臨床使用，無免疫排斥問題，但是MSCs只占整個骨髓中有核細胞的十萬分之一，并隨年齡的增加而減少，同時骨髓還含有其它多種細胞成分，因此至今尚無一個理想的獲取較高純度MSCs的分離、純化及體外擴增方案。

本研究對密度梯度離心及貼壁篩選法分離大鼠骨髓間充質干細胞的純度及增殖特性進行了比較，發現貼壁法雖然簡單，但所獲細胞成分復雜，細胞純度不足，其中可見許多紅細胞以及形體較大、含有多個核的破骨樣和巨嗜細胞樣細胞。經多次傳代仍可見較多雜質細胞存在，且增殖活力相對較低，對細胞純度要求較高的組織工程來說作為種子細胞并不是很理想。密度梯度離心法分離的骨髓間充質干細胞雜質細胞少，細胞活力強，增殖速度快，原代細胞可形成均一的增殖集落，并能穩定傳代，保持其多項分化潛能的特性。該結果與多數文獻相一致，說明密度梯度離心法是目前分離純化MSCs的較好方法。

油紅O染色是檢測脂肪細胞的特異性方法，而MSCs要作為脂肪組織工程的種子細胞，首先要分化成脂肪細胞。在本研究中通過應用地塞米松，IBMX，人胰島素，吲哚美辛誘導，兩種方法獲得的MSCs于誘導14天后，油紅O染色多數細胞均呈陽性，而未誘導的對照組均表現為陰性。兩種方法所獲得的骨髓間充質干細胞所形成的脂滴數量經統計學分析無顯著性差異，說明兩種方法所分離的細胞在成脂誘導條件下向成脂肪分化的能力是相似的。

綜上所述，密度梯度離心法是體外分離、純化MSCs的良好方法，應用此方法分離純化MSCs可用于組織工程學研究。

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。