ｐ２７基因轉(zhuǎn)染對增生性瘢痕成纖維細胞－膠原網(wǎng)收縮的影響

韓軍濤 朱雄翔 王洪濤

[摘要]目的：研究p27對增生性瘢痕成纖維細胞－膠原網(wǎng)收縮的影響差異，探討p27在瘢痕形成中的作用。方法：取體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細胞(HTsFb)，p27基因轉(zhuǎn)染HTsFb，建立成纖維細胞－膠原網(wǎng)模型，觀察p27基因轉(zhuǎn)染對p27基因轉(zhuǎn)染HTsFb－膠原網(wǎng)收縮的影響差異。結(jié)果：p27能抑制HTsFb－膠原網(wǎng)收縮。結(jié)論：p27可能通過抑制瘢痕收縮來抑制瘢痕形成。

[關(guān)鍵詞]P27；成纖維細胞膠原網(wǎng)；瘢痕

[中圖分類號]R619．6 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)01—0019－02

細胞周期調(diào)節(jié)蛋白在正常細胞的生長和腫瘤的發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用。細胞周期素依賴性激酶(CDKs)是細胞周期進展的主要調(diào)節(jié)因子，CDKs能夠使Rb基因及其相關(guān)蛋白磷酸化，反過來又受到細胞周期素(cyclin)的水平，磷酸化和細胞周期素依賴性激酶抑制劑(CKIs)的控制。作用CDK的抑制蛋白p27，已證明是潛在的腫瘤抑制因子或抑癌基因。p27主要是通過與cyclin E-CDK2復(fù)合物的相互作用，從而調(diào)節(jié)細胞從G1后期到S期。目前認為p27是TGF-β、cAMP及其他細胞外因子誘導(dǎo)細胞生長停滯的主要介質(zhì)。成纖維細胞一膠原網(wǎng)系統(tǒng)是研究創(chuàng)面愈合與瘢痕攣縮較為先進的三維立體培養(yǎng)模型，我們以成纖維細胞－膠原網(wǎng)為模型，研究了抑癌基因p27轉(zhuǎn)染對人增生性瘢痕成纖維細胞－膠原網(wǎng)收縮影響，探討抑制瘢痕攣縮可能的機制，以期為瘢痕的防治提供新的途徑。

1 材料和方法

1．1材料：p27-pcDNA3真核表達質(zhì)粒由作者本人構(gòu)建，DMEM為GIBCO公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為DIBCO公司產(chǎn)品，新生小牛血清為上海產(chǎn)。

1．2方法

1．2．1成纖維細胞培養(yǎng)及脂質(zhì)體介導(dǎo)的p27基因轉(zhuǎn)染參照文獻進行。

1．2．2鼠尾膠原的提取及定量：取wistar鼠尾2根，750ml／L乙醇浸泡20min，生理鹽水漂洗3次，無菌條件下抽出尾腱，溶于1ml／L醋酸溶液500ml中。4℃下攪拌48h，取上清，紫外分光光度法定量蛋白質(zhì)含量為0．2g/L，用于實驗。 1．2．3成纖維細胞膠原網(wǎng)凝膠系統(tǒng)的建立取對數(shù)生長期HTsFb，調(diào)整細胞濃度為3．0×10⁸／L，將細胞懸液，10×DMEM，11．76g/L NaHCO₃，0．2g/L鼠尾膠原按2：1：2：5的比例，將四種成分快速混勻，用1mol／L NaOH及0．4mol／L NaOH調(diào)整pH值至中性，形成成纖維細胞膠原混懸液，將該混懸液移入直徑33mm的培養(yǎng)皿中，2ml／皿，置37℃、50ml／LC02孵箱中10min，混懸液即形成凝膠，輕叩皿底，使凝膠塊和皿底分離，然后每皿加入含10g/LFCS的DMEM 1mL，設(shè)置A：空白對照：B：pcDNA3：C：DcDNA3-p27三組，繼續(xù)培養(yǎng)，以不同時間點凝膠塊的面積與初始面積百分比(Percentage of Area)來表示凝膠收縮的程度。

2 結(jié)果p27對HTsFb膠原網(wǎng)收縮的影響

2．1細胞形態(tài)與分布：成纖維細胞膠原網(wǎng)(fibroblast-populated collagen lattice，F(xiàn)PLC)形成時呈透明狀態(tài)，凝膠化以后變成不透明可被握持的凝膠塊。當(dāng)凝膠與培養(yǎng)皿分離后則凝膠塊和圓盤狀漂浮在培養(yǎng)液表面，在倒置顯微鏡下，可清楚地看到各個層次的細胞及其形態(tài)。成纖維細胞在凝膠中的位置相對固定，不象在普通二維培養(yǎng)系統(tǒng)中那樣迅速沉淀，說明此時成纖維細胞已經(jīng)粘附在膠原支架上，約4～6h后，經(jīng)胰酶消化后呈圓形的成纖維細胞表面逐漸伸展延長，形成較多的胞質(zhì)突起，隨著時間的推移，這些突起在細胞的兩極逐漸伸展延長，但數(shù)目逐漸減少，最后在細胞的兩極形成兩個較長的突起，使細胞大致成長梭形。伴隨著凝膠塊的收縮，成纖維細胞變得更加致密，有時互相交織成網(wǎng)狀，A、B、C三組成纖維細胞的形態(tài)及排列未發(fā)現(xiàn)明顯差異，在早期(24h)內(nèi)，轉(zhuǎn)染P27的C組瘢痕成纖維細胞伸展開的時間較早，且收縮速度較A，B組細胞膠原網(wǎng)快，C組瘢痕成纖維細胞在相同的時間點顯得較為致密，但后期(＞24h)收縮速度較A，B組細胞膠原網(wǎng)快，C組瘢痕成纖維細胞在相同的時間點顯得較為稀疏。

2．2 P27對HTsFb-膠原網(wǎng)收縮的影響：在快速收縮時相(24h內(nèi))，P27對瘢痕成纖維細胞膠原網(wǎng)收縮有明顯的促進作用；而在延緩收縮相(超過24h)則對瘢痕成纖維細胞膠原網(wǎng)收縮有明顯的抑制作用(見圖1)。

3 討論

傳統(tǒng)的成纖維細胞體外二維培養(yǎng)方法，使我們能將成纖維細胞從體內(nèi)錯綜復(fù)雜的因素中分離出來，置于一定的因素控制下，觀察細胞的生物學(xué)行為，從而為創(chuàng)面愈合及瘢痕異常增生提供實驗理論依據(jù)，但是二維培養(yǎng)方法忽視了細胞外基質(zhì)與成纖維細胞的相互作用。近年來，很多實驗證明了細胞外基質(zhì)一方面維持正常的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，另一方面與細胞相互作用、相互依存，對維持正常的細胞形態(tài)及增殖分化、合成代謝的功能非常重要。1979年Bell設(shè)計了FPCL模型，更加類似于體內(nèi)環(huán)境，得到廣泛應(yīng)用。1995年Tsai等用增生性瘢痕和正常皮膚來源的成纖維細胞形成FPCL，發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕來源的FPCL收縮快，收縮能力強。這些研究中都顯示增生性瘢痕來源的可收縮的FPCL能較好地保持增生性瘢痕的特征，是較為理想的增生性瘢痕體外模型。

含成纖維細胞膠原網(wǎng)的收縮過程大致上可分為兩個時相：①快速收縮時相：發(fā)生在收縮過程的早期，本實驗主要發(fā)生在24h以內(nèi)；②延緩收縮相，兩收縮時相之間并無明顯界限．凝膠收縮的過程受細胞組織來源及其功能狀態(tài)、細胞濃度、膠原濃度、血清含量及細胞因子的含量等多種因素的影響，本實驗發(fā)現(xiàn)在快速收縮時相(24h內(nèi))，P27對瘢痕成纖維細胞膠原網(wǎng)收縮有明顯的促進作用；而在延緩收縮時相(超過24h)則對瘢痕成纖維細胞膠原網(wǎng)收縮有明顯的抑制作用。

成纖維細胞膠原網(wǎng)收縮的機理是由于成纖維細胞產(chǎn)生的張力，作用于膠原纖維，使之發(fā)生重排或改構(gòu)，導(dǎo)致固相與液相相互分離的結(jié)果，這一過程對類似于傷口收縮的過程。我們分析在快速收縮時相p27對FPLC收縮的刺激作用提示在傷口愈合早期可能通過促進成纖維細胞的收縮功能來促進創(chuàng)面愈合，而在傷口愈合后期可能通過抑制成纖維細胞的收縮功能來抑制瘢痕攣縮．其對成纖維膠原網(wǎng)的作用機制可能是多方面的，在早期可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)各種生長因子的表達，改變細胞內(nèi)各種張力纖維，張力蛋白如α-SM actin的表達、以及微絲微管的數(shù)量改變或排列，以及調(diào)節(jié)成纖維細胞與膠原之間的粘附、影響成纖維細胞的增殖與凋亡等多種途徑來實現(xiàn)，具體的機制尚需進一步探討。

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。