胎兔皮膚無瘢痕愈合相關蛋白的篩選與初步分析

李 楊

[摘要]目的：篩選胎兔皮膚組織無瘢痕愈合相關蛋白，并初步分析其在無瘢痕愈合過程中的作用。方法：建立胎兔背部切割傷模型，運用蛋白質組雙向電泳技術篩選胎兔皮膚傷后差異表達的蛋白質，并進行質譜和數據庫檢索分析。結果：篩選出20個在傷后胎兔皮膚組織中特異高表達的蛋白質點，經過質譜和數據庫檢索分析后確定：伴侶素或線粒體蛋白P₁前體、彈性蛋白(Vi－mentin，Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖核蛋白H(異質性胞核核糖核蛋白H)、α烯醇酶(α－磷酸丙酮酸水合酶)等無瘢痕愈合相關蛋白在胎兔皮膚傷后表達增加。結論：上述無瘢痕愈合相關蛋白可能通過對基因轉錄和翻譯的調控，促進膠原蛋白等的合成和正確的折疊、裝配，以及促進細胞的增殖、分化和發育等，促進胎兔皮膚創傷的修復，參與其無瘢痕愈合過程。

[關鍵詞]胎兔；皮膚；無瘢痕愈合；創傷：蛋白質組；基質輔助的激光解析電離／飛行時間質譜

[中圖分類號]R641 Q591．2 R751 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)01—0011－04

自Burrington首次發現胎兒皮膚創傷后修復無瘢痕形成，并確立了“無瘢痕愈合”(Scarless Healing、Scar-free Healing)的概念以來，“無瘢痕愈合”模式成為人們孜孜以求的理想，但至今胚胎個體“無瘢痕愈合”的具體機制還不清楚。我們在前期的研究中發現在胎兔皮膚創傷無瘢痕愈合過程中確有基因表達的差異存在，且差異表達基因可能在其過程中具有重要的作用。而基因最終是通過蛋白質的表達才發揮其功能，本實驗運用雙向電泳技術，篩選胎兔皮膚無瘢痕愈合相關蛋白，并進行初步分析。

1 材料和方法

1．1動物與試劑：健康雌性大耳白兔20只，體重(3．0～3．5)kg(第三軍醫大學大坪醫院動物中心)，“速眠新”合劑(長春農牧大學獸醫研究所)，哺乳動物總蛋白提取試劑盒(Merck公司)，pH4-7、11cm固相pH梯度(Immoblilized pH gradient，IPG)預制膠條(Bio-Rad公司)，銀染增強型試劑盒(Bio-Rad公司)。

1．2動物致傷與分組：對20只妊娠20天的雌兔進行麻醉后，無菌條件下對胎兔背部致切割傷，傷后繼續飼養。以20只致傷胎兔作為創傷(Fetal trauma，FT)組，20只同胎未致傷胎兔作為對照組(Fetal control，FC)，20只妊娠兔作為成年創傷對照(Adult trauma control，A7C)組。于傷后24h分別取各組兔傷口處皮膚組織。

1．3總蛋白質提取：用哺乳動物總蛋白提取試劑盒提取兔皮膚組織的總蛋白，并用Bradford法測定其濃度。

1．4胎兔皮膚蛋白質組雙向電泳：采用pH值范圍4～7、長11cm的IPG膠條進行雙向電泳。被動水化；第一向等電聚焦：電壓8000V，總聚焦60000Vh：第二向十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)：分離膠采用10％的丙烯酰胺凝膠，分離膠電流30mA／gel，電泳凝膠用硝酸銀染色的方法進行染色。

1．5差異蛋白質點選取及初步分析：相同條件下分別對FT、FC、ATC三組兔皮膚總蛋白進行三次雙向電泳。凝膠圖譜用ImageMaster 2D Platinum圖像分析軟件分別進行分析，并對三組樣品電泳凝膠進行差異比較分析。

對F7組特異高表達差異蛋白質點進行基質輔助的激光解析電離／飛行時間質譜(Matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrogram，MALDI-TOF-MS)分析，得到各蛋白點的肽指紋圖譜，然后將肽指紋圖譜進行數據庫檢索，分析其功能。

2 結果

2．1動物模型：成年雌兔均健康存活；致傷胎兔死亡4只，存活16只，手術成功率80％；對照胎兔均成活。

2．2皮膚組織總蛋白質：各組樣品組織總蛋白濃度分別為：F7組(3．22～4．44)μg/μl、FC組(3．12～4．62)μg/μl、ATC組(16．54～18．96)μg/μl，各組樣品總蛋白量分別為：FT組(3886～4664)μg、FC組(3880~4862)μg、ATC組(12432～14226)μg。

2．3總蛋白質雙向電泳及無瘢痕愈合相關蛋白的篩選：胎兔致傷組3張電泳圖譜上分別檢測到91個、107個和117個蛋白質斑點，平均蛋白質點(105±14)個；胎兔對照組分別檢測到89個、107個和127個蛋白質斑點，平均蛋白質點(108+19)個；成年創傷對照組分別檢測到49個、62個和89個，平均蛋白質點(67±22)個。

選取FT組、FC組、ATC組各自三次電泳圖譜中蛋白質點分離較好，數量居中的凝膠作為參考膠，見圖1。將胎兔致傷組的參考膠圖譜分別與胎兔對照組和成年創傷對照組的參考膠圖譜進行比對分析，尋找致傷胎兔表達的差異蛋白質點，即無瘢痕愈合相關蛋白質。本實驗得到致傷后胎兔皮膚差異表達的蛋白質點20個，主要分布在(4．3～6．62)kDa之間(見圖2)。

2．4 無瘢痕愈合相關蛋白分析：篩選出20個在傷后胎兔皮膚組織中特異高表達的蛋白質點，經過質譜、同源性分析和相似性檢索后，確定其中有意義的蛋白質為：伴侶素或線粒體蛋白P．前體、彈性蛋白(Vimentin，Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖核蛋白H(異質性胞核核糖核蛋白H)、α－烯醇酶(α－磷酸丙酮酸水合酶)。

3 討論

哺乳動物胚胎無瘢痕愈合的機制至今不清，研究顯示，胎兒具有的無瘢痕愈合的能力可能與其在胚胎期對炎癥的低反應性、效應細胞——纖維母細胞的數量和功能、細胞外基質的成分和含量以及同源異性盒基因(PRX-2和HOXB13)的表達差異等有關，而與胎兒宮內的特殊生長環境無明顯關系。我們前期實驗從遺傳學物質基礎出發即尋找基因的差異表達，用改良的SSH篩選出與胎兔皮膚傷后無瘢痕愈合相關的基因片段42個，也提示在胎兔創傷無瘢痕愈合過程中確有基因表達的差異存在。

通過在相同條件下比較具有表型差異的不同樣品之間蛋白質表達的異同，尋找與生理／病理現象相關的差異蛋白質，即有可能揭開某些生理／病理現象的機制，并提供可以對其進行人為干預的靶點。基于以上思路，我們在相同條件下同步進行雙向電泳，比較分析電泳凝膠，尋找切割傷后胎兔皮膚組織的蛋白質組與對照未致傷胎兔和對照致傷成年兔皮膚組織的蛋白質組表達的差異，從而找出胎兔皮膚傷后無瘢痕愈合相關蛋白質，對其進行初步的鑒定和分析，了解其在胎兔無瘢痕愈合中的作用，為人為的干預和治療瘢痕增生過度或增生不良提供理論基礎。

3．1 伴侶素／線粒體蛋白P₁前體：分子伴侶是一類在細胞內能夠協助其他多肽進行折疊、組裝、轉運、降解的蛋白，并在DNA的復制、轉錄、細胞骨架功能、細胞內的信號轉導等領域發揮著重要的生理作用。分子伴侶分為許多不同的家族，如Hsp100，Hsp90，Hsp70，伴侶素(Hsp60)，DaJ(Hsp40)，Hsp27，家族蛋白粒體蛋白P₁前體(mitochondrial protein P1 precursor)等，這些成員廣泛分布在原核生物及真核生物細胞中，它們在細胞內蛋白質的折疊過程中相互協同，共同發揮著重要的作用。

線粒體基質蛋白P₁前體在往線粒體內輸入蛋白質和大分子裝配中發揮作用，協助輸入蛋白質的正確折疊，并能阻止錯誤的折疊和促進應激條件下產生的未折疊多肽的重折疊和正確的裝配。伴侶素／線粒體蛋白P₁前體在胎兔皮膚傷后表達增加，它們能協助其他蛋白和多肽的折疊、組裝和轉運、維持正確構象的微管蛋白和微絲蛋白，保持正確的細胞骨架促進傷口的愈合。

3．2波形蛋白和微管蛋白β多肽：波形蛋白(Vimmentin，Vim)是中等纖維的主要成分之一，在成纖維細胞中起到細胞支架與網絡的作用。在皮膚結締組織等間葉起源的細胞如：成纖維細胞、軟骨細胞、內皮細胞、某些肌肉細胞等中，中等纖維也以波形蛋白占絕大部分。有實驗發現在腦穿刺傷后的神經膠質細胞中Vim及其mRNA的表達均增加，且與膠質瘢痕的形成關系密切：在深Ⅱ度和全層皮膚損傷愈合后攣縮瘢痕的研究中發現，波形蛋白在損傷后明顯的增加，Vim的基因在增生性瘢痕中表達也增加，因此有研究者認為Vim與瘢痕增生有關。也有實驗觀察到在肌肉損傷和再生過程中Vim表達也增加，提示Vim可能在組織損傷后的再生和修復過程中發揮重要作用。

微管是真核細胞所獨有的結構，存在于細胞基質，屬于一種保守成分。微管主要由微管蛋白組成，是真核細胞普遍存在的細胞骨架，它還參與細胞的增殖、分化。B微管蛋白與細胞增殖分化有密切關系，當細胞從GO期進入S期使細胞由靜止狀態進入增殖狀態時，必伴隨β微管蛋白的基因表達及其蛋白合成。有實驗發現用燒傷血清刺激大鼠腸上皮細胞后微管蛋白表達減弱，該現象可能與腸上皮損傷有關。

本實驗發現Vim在傷后的胎兔皮膚組織中表達高于未致傷胎兔和傷后的成年免。可以試想Vim在成年個體傷后可能促進瘢痕的增生，而在胚胎時期可能具有調整膠原纖維的排列，抑制瘢痕增生的作用，從而促進胎兔創口組織的再生與愈合。胎兔傷后的皮膚中微管蛋白β多肽表達增多，也提示微管蛋白可能從促進細胞增殖、分化和保護上皮組織等方面在胎兔皮膚創傷的修復中起到一定作用。

3．3 核不均一核糖核蛋白H：核不均一核糖核蛋白(異質性胞核核糖核蛋白)(Heterogeneous nuclearribonucleoprotein，hnRNP、是一組RNA結合蛋白，它包括近30種與核酸結合的蛋白質，在基因轉錄、核內mRNA前處理以及胞質的mRNA翻譯時起重要作用。hnRNP H是hnRNP家族的一個亞型，主要富集于細胞核內，它作為剪接增強子復合物的組成部分參與細胞的轉錄和翻譯控制，其具體機制是hnRNP H能和相關蛋白如：hnRNP F等相互作用，其作用方式可能是hnRNP H和相關蛋白hnRNP F在單個增強子復合體中以異源二聚體的形式存在并相互作用，從而完成基因的剪接，調節基因的轉錄與翻譯。Liu等體外實驗發現hnRNP H通過對細胞轉錄、翻譯的調控可以抑制干細胞的肌形成。本實驗在創傷胎兔的皮膚中觀察到hnRNP H的表達增加，它可能也通過對基因轉錄、翻譯的調節實現對相關蛋白翻譯的調控，從而發揮其在無瘢痕愈合中的作用。

3．4 α－烯醇酶：α－烯醇酶能調控缺氧誘導因子、核呼吸因子l，參與糖分解酶的調控，它還是細胞質中磷酸烯醇丙酮酸形成過程中重要的糖酵解酶。有學者發現烯醇酶可與人的纖溶酶原、唾液腺粘蛋白MG2結合，并可能在變形鏈球菌黏附、清除或突破血流屏障中起一定的作用。實驗發現α－烯醇酶組成纖溶酶原的受體，而該受體通過在細胞表面富集纖溶蛋白酶或增強其生成，從而在骨骼肌形成過程中發揮重要作用。在小細胞肺癌中α－烯醇酶表達下調，并可能在腫瘤發生過程中起重要作用。但α－烯醇酶在創傷或皮膚組織中的作用和功能鮮有研究，因此其在胎兔皮膚組織無瘢痕愈合中的作用有待進一步研究闡明。

綜上所述，本實驗篩選出的蛋白與基因轉錄調控、細胞信號轉導、細胞增殖、分化、發育等功能有關，這一結果與前期實驗在創傷胎兔皮膚組織中篩選出與信號轉導、細胞增殖、分化、發育相關基因的表達上調相互印證。因此可以設想：胎兔皮膚創傷后Vim、微管蛋白β多肽等促進細胞增殖、分化和發育，并維持其正常的細胞形態和結構；hnRNP H調控基因的轉錄和翻譯，促進膠原蛋白等的合成：同時伴侶素協助多肽進行折疊、組裝、轉運，并能阻止錯誤的折疊和促進未折疊多肽的重折疊和正確的裝配；α－烯醇酶可能以酶的身份參與其中，調節這些過程的完成。無瘢痕愈合相關蛋白通過這些作用，可能使膠原纖維等成分維持正常的排列，從而抑制瘢痕的過度增生，參與胎兔無瘢痕愈合過程。

編輯／張惠娟

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