骨髓基質干細胞復合納米羥基磷灰石／聚乳酸構建組織工程骨

劉雪梅

[摘要]目的：了解骨髓基質干細胞(MSCs)復合納米羥基磷灰石／聚乳酸(n—HA／PLA)構建組織工程骨的異位成骨作用。方法：選擇6只新西蘭白兔，實驗組于動物脊柱左側肌肉內植入MSCs復合n—HA／PLA構建的組織工程骨，對照組于右側植入n—HA／PLA生物材料。術后4、8周取材，行溴脫氧尿嘧啶(Brdu)標記細胞檢測和組織學觀察。結果：術后4周，實驗組材料邊緣均可檢測到Brdu標記的MSCs。術后4、8周，實驗組材料內部有新骨形成，隨著時間推移，新骨量增多，編織骨向板層骨過渡。對照組材料未見新骨形成。結論：MSCs復合n—HA／PLA構建的組織工程骨具有很好的異位成骨作用。

[關鍵詞]骨髓基質干細胞；納米羥基磷灰石；聚乳酸；組織工程

[中圖分類號]Q813 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)01—0025－03

目前對骨組織工程支架材料的研究很多，但尚未找到，種理想的材料。單一類型的支架材料存在各自的優缺點，僅靠單一材料很難滿足骨組織工程支架材料的要求。理想的骨組織工程支架材料的制備應考慮到無機陶瓷類材料、合成聚合物材料和天然生物衍生材料的優缺點，將有機材料和無機材料通過合適的方法組合成復合材料，模擬天然骨基質組成成分，通過促進種子細胞的粘附、增殖和分化，從而發揮最佳的成骨能力。納米羥基磷灰石／聚乳酸(n—HA／PLA)就是根據這一原理將無機材料納米羥基磷灰石與有機材料聚乳酸通過特殊工藝聚合而成的新型生物材料，本實驗旨在研究復合生物材料n—HA／PLA作為組織工程支架材料的可行性。

1 材料和方法

1．1 MSCs的分離培養與誘導：取健康新西蘭白兔2只，雙側脛骨結節處備皮消毒，無菌條件下用骨穿針穿刺抽取紅骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培養液(Gibco公司)，混勻后加入3ml淋巴細胞分離液(Gibco公司)，1800r／min離心10min，吸除中間層細胞后再離心，所得細胞沉淀以1×10⁶／ml密度接種于含15％胎牛血清的DMEM培養液中，于37℃、5％CO₂飽和濕度條件下培養。待細胞相互融合達90％生長面積時用0．25％胰蛋白酶(Sigma公司)消化傳代培養。細胞傳至3代時，移入含10～8mol／L地塞米松、50mg/L維生素C和10～2mol／Lβ－磷酸甘油鈉的DMEM培養液誘導培養3天，誘導后的細胞表型經鑒定為成骨樣細胞。移入含0．2％BrdU的無血清培養液(按200μl BrdU／100ml DMEM培養液的比例配制)中，于37℃、5％C0₂飽和濕度條件下培養1h標記細胞。

1．2組織工程骨的制備：n-HA／PLA由美國印第安那大學醫學院生物工程研究室提供，材料規格為１5mm×10mm×5mm大小，環氧乙烷消毒后備用。將n-HA／PLA支架材料用DMEM培養液浸泡1天后棄殘液，每個支架材料以1×10⁶／ml密度接種經誘導培養的MSCs，于37℃、5％CO₂飽和濕度條件下培養3天。術前清晨更換不含青霉素和鏈霉素的無血清培養液。

1．3動物模型和實驗分組：6只新西蘭白兔全身麻醉，常規消毒頸背部，于脊柱棘突兩側各作長約2cm切口，依次切開皮膚和皮下組織，顯露肌組織，分開肌間隙，將移植材料植入肌腹內，逐層縫合切口。實驗動物自身作對照，于動物脊柱左側肌肉內植入組織工程骨，右側植入單純支架材料。

1．4 檢測項目

1．4．1大體觀察：術后觀察動物飲食、活動，傷口有無腫脹、分泌物等。術后4周處死動物，取出移植材料，觀察移植物的顏色、質地和血管形成，與周圍軟組織分布情況。

1．4．2 BrdU標記細胞檢測：術后4周部分標本經4％多聚甲醛固定1周后，乙醇梯度脫水。有機樹脂包埋，硬組織切片機制作厚度為5μm切片標本，用免疫組化的方法檢測標記細胞。切片標本用0．3％H₂O₂一甲醇處理30min滅活內源性氧化酶，5％正常兔血清封閉，甲酰胺100℃變性核酸5min，冰浴冷卻后PBS洗滌，加工作濃度為1：50的小鼠BrdU單克隆抗體。陰性對照以PBS代替一抗。顯微鏡下觀察，細胞核內棕色顆粒為陽性細胞。

1．4．3組織學觀察：標本經4％多聚甲醛固定，用10％EDTA脫鈣，常規脫水、浸蠟和包埋，石蠟切片厚度5μm，行HE染色，顯微鏡下觀察植入材料內新骨形成的情況。

2 結果

2．1大體標本觀察：術后8周，各組植入材料周圍軟組織未見壞死、化膿、積液等現象，可見各組材料有大量纖維組織和血管等軟組織包裹和長入，很難將其分離。

2．2 BrdU標記細胞檢測：將BrdU標記的MSCs與n-HA／PLA支架材料復合物植入動物體內，術后4周取出標本，免疫組化方法檢測標記細胞，支架材料邊緣可檢測到BrdU標記的MSCs(圖1)，MSCs呈陽性反應，陽性物質為棕黃色細顆粒，分布于MSCs細胞內，陰性對照中細胞內和細胞外基質未見陽性信號。

2．3組織學觀察結果：術后4周，實驗組標本可見有軟骨帶形成，其中有少量鈣化的骨組織，周圍可見梭形的間充質細胞向軟骨細胞分化(圖2)。術后8周，實驗組標本可見有編織骨形成，并可見髓腔形成，其內見有島狀骨小梁，周邊仍可見軟骨細胞。隨植入時間的延長，組織工程骨逐漸被降解吸收，且新骨或軟骨形成增多，并有血管、纖維組織、脂肪、肌肉組織長入材料間隙內。術后4周和8周，對照組植入的生物材料中未見任何軟骨或新骨形成，隨著植入時間的延長，材料逐漸被降解吸收，可見周圍的肌肉組織、纖維組織和血管等由外向內逐漸長入材料孔隙內(圖3)。

3 討論

羥基磷灰石(hydroapatite，HA)作為骨修復材料最大缺點是生物力學強度明顯低于正常骨，這就決定了HA只能作為充填材料，不適用于負重骨缺損的修復。同時HA移植修復骨缺損，在新骨形成和材料降解吸收的過程中，新骨不能完全恢復至HA移植前的形態，形成的新骨量具有不可預測性。因此HA不適用于負重骨缺損的修復，或是對外形要求很高的頜面外科修復。將無機材料納米羥基磷灰石與有機材料聚乳酸通過特殊工藝聚合而成的新型生物材料n-HA／PLA，其形態、結構和成分與人體骨中磷灰石晶體結構相似。與普通HA相比較，n-HA／PLA具有良好的骨傳導性、骨誘導性和生物相容性，并且其生物力學強度，特別是抗壓、抗折彎和彈性模量與人體皮質骨相近。n-HA／PLA的主要礦物相為低結晶度和納米量級含碳酸根的羥基磷灰石，與入骨的天然成分相同，因此n-HA／PLA具有良好的組織親和性和結合力。研究表明骨替代材料相互連通的孔隙是新骨形成的先決條件：100～500μm的孔徑有利于成骨細胞黏附生長、爬行替代和牛物礦化過程；孔徑在40～100μm之間，只能產生類骨質；孔徑小于40μm，則只能產生肉芽組織。本實驗采用的n-HA／PLA生物材料網孔平均孔徑為300μm，孔隙率為80％，具有三維立體網狀孔隙系統，仿生生物骨的骨小梁、小梁間隙和骨內管腔結構，這種結構有利于種子細胞的粘附和生長，并可為細胞外基質的分泌提供寬大表面積和內部空間。本實驗中MSCs在n-HA／PLA支架材料上黏附、增殖、分化良好，表明n-HA／PLA是一種較好的骨組織工程支架材料。

異位成骨是指在肌肉等非骨組織內成骨，正位成骨是指在骨膜下或骨組織內成骨。由于異位成骨具有正位成骨的所有形態結構和代謝特性，排除正位骨化由于受體骨或骨膜成骨的假陽性結果，容易解釋新骨形成的細胞來源，則研究結果更為真實可信L6)。本實驗將BrdU標記的MSCs復合n-HA／PLA構建組織工程骨植入動物肌肉內進行異位成骨的研究。BrdU與脫氧尿嘧啶結構相似，BrdU能在細胞周期S期專一摻入DNA，且BrdU單克隆抗體不與胸腺嘧啶發生交叉反應，故BrdU標記細胞具有很高的準確性和安全性，現已廣泛地應用于細胞動力學研究中。BrdU標記細胞一般在體內8周可檢測到，最長不超過12周。本研究結果表明，將Br-dU標記的MSCs與n-HA／PLA支架材料復合物植入動物體內，術后4周取出標本，免疫組化方法檢測標記細胞，實驗組材料邊緣均可檢測到BrdU標記的MSCs，陰性對照中細胞內和細胞外基質未見陽性信號。以上結果說明組織工程骨的種子細胞在宿主體內存活、生長、增殖和分化，分泌含有骨形態發生蛋白、轉化生長因子β等骨源性生長因子的基質，誘導結締組織中的間充質細胞、骨髓基質細胞或滑膜細胞向軟骨細胞或成骨細胞分化，通過膜內化骨或軟骨內化骨形成新骨；骨源性生長因子通過細胞間的信號傳導趨化破骨細胞的聚集，降解并吸收材料以促進更多的新生骨形成。本研究結果表明，沒有復合MSCs的生物材料未見任何軟骨或骨組織形成，而組織工程骨均有軟骨或骨組織形成，說明單純的生物材料只起支架作用，組織工程骨異位成骨的細胞來源于MSCs，表明構建組織工程骨復合種子細胞是必需的。本研究中還發現，組織工程骨體內植入后先有軟骨形成，后經形態發生形成骨組織，進一步表明支架材料復合MSCs體內成骨是通過軟骨化成骨，其吋能機制是MSCs先分化生成軟骨組織，而支架材料降解后釋放的鈣則沉積于軟骨基質以促進軟骨鈣化形成骨組織。

編輯／張惠娟

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