大鼠脂肪干細胞（ｒＡＤＳＣｓ）轉運ＶＥＧＦ基因促進隨意皮瓣成活率的研究

魯開化 趙京禹 孫同柱 韓 冰 陳 偉

[摘要]目的：探討人血管內皮細胞生長因子(VEGF165)基因轉染大鼠脂肪干細胞(rADSCs)的穩定表達系統對皮瓣成活的影響。方法：①培養和鑒定大鼠ADSCs，脂質體介導pcDNA3．1－VEGF165質粒轉染大鼠(rADSCs)，經G418篩選抗性rADSCs并繼續培養4周，用ELISA法檢測轉染后細胞培養上清中VEGF濃度。②Brdu標記被轉染rADSCs后，在大鼠背部制備8．0cm×2．5cm的隨意型皮辦模型，實驗組(10只大鼠)為注射pcDNA3．1-VEGF165質粒轉染的rADSCs懸液到大鼠腹腔，對照組(8只大鼠)為注射2ml被空載體pcDNA3．1(一)轉染的rADSCs懸液，術后7天用透明紙描記法記錄皮瓣成活范圍，記數坐標紙格子并換算為成活面積百分率。分別于術后3天、5天、7天在成活皮瓣的遠端切取皮瓣組織標本行免疫組化染色。結果：①ELISA檢測4株轉染和經G418篩選抗性并繼續培養2周的第二代rADSCs上清中VEGF濃度多達(4．21±0．35)pmol VEGF／1×10⁶細胞／48h(x±s，n=4)，有2株細胞培養液上清分泌VEGF較強，其余2株細胞相對較弱，均大于對照的空載體轉染組和未轉染組rADSCs培養液上清中的(0．49±0．15)pmol VEGF／1×10⁶細胞／48h(x±s，n=3)和(0．61±0．86)pmol VEGF／1×10⁶細胞／48h(x±s，n=3)，均P<0．01，差異有統計學意義。分泌VEGF較強的rADSCs經Brdu標記后陽性率達到70％以上。②將獲得的穩定表達VEGP165的rADSCs移植到隨意型皮瓣動物模型體內，7天后實驗組皮瓣的成活面積為(59．6±0．52)％，大于對照組的皮瓣成活面積(40．5±0．27)％(P<0．01)。成活皮瓣的遠端組織標本切片在顯微鏡下可見皮下脂肪中有大量核仁深染棕黃色的細胞。結論：ADSCs可以作為載體細胞運送VEGF基因到達皮瓣遠端并通過分泌VEGF提高皮瓣的成活面積。

[關鍵詞]成體干細胞；基因治療；隨意型皮瓣

[中圖分類號]Q789 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)01-0007-04

皮瓣是用于修復較大的組織缺損和外露臟器的帶血供的皮膚軟組織，但是在轉移手術后皮瓣經常發生血運障礙。研究表明，血管內皮細胞生長因子(VEGF)可以促進血管的新生，從而提高缺血皮瓣的成活面積。成體干細胞載體可以治療多種疾病。研究表明，MSC等成體干細胞可以作為中樞神經性疾病等多種疾病的基因治療載體，例如MSC可以作為VEGF、FGF等多種細胞因子基因治療的載體，并通過旁分泌作用釋放VEGF促進側支循環的建立和血管的再生，而MSC自身則不參與缺血組織的治療。目前ADSCs作為基因治療載體的報道較少見，本研究旨在闡明脂肪干細胞可以作為運送VEGF基因到達皮瓣的細胞載體并通過旁分泌VEGF提高皮瓣的成活面積。

1 材料和方法

1．1材料：3周齡SD大鼠18只(雌雄不限)、Lipo-fectamineTM2000(美國Sigma公司)、pcDNA3．1-VEGF165質粒(本室構建并保存)、DMEME(Dul—beccos modified eagle balancedsalt solution)培養基、0．1％Ⅰ型膠原酶(美國Worthington公司)、CD49天抗體(北京中山生物技術公司)、恒溫CO₂培養箱、臺式離心機(LingLi公司)、Calibur型四色流式細胞儀(美國Becton Dickinson)、DMIRB型倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)。

1．2方法

1．2．1 rADSCs的分離和原代培養：SD大鼠麻醉后，在無菌下切取腹股溝脂肪墊，剪碎后加入0．1％Ⅰ型膠原酶消化40～60min，加入2倍體積的D-Hank’s液，離心收集沉淀并用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養基稀釋，轉種到培養瓶中。

1．2．2 rADSCs的鑒定：收集處于對數生長期的第2代rADSCs，95％乙醇固定和漂洗后分別加入鼠抗鼠的CD49天單克隆抗體，4℃過夜，PBS洗掉未結合的抗體，加入異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠二抗，室溫下放置30min，PBS洗掉未結合的抗體。用流式細胞儀檢測。同時用PBS／FBS／NANO₃代替一抗作為空白對照。

1．2．3脂質體介導VEGF轉染rADSCs：生長到70％～80％融合的細胞，用新鮮無血清DMEM培養基洗滌2遍。按LipofectamineTM2000操作說明，pcDNA3．1(一)、pcDNA3．1－VEGF165質粒分別8．0μg和LipofectamineTM2000 20μl混合，室溫靜置20min后，加入1ml不含血清的DMEM培養基，37℃、轉染rADSCs 8h后，換成含血清的DMEM培養基繼續培養24h，換成最小致死劑量0．5g/L的G418選擇培養基，抗性細胞篩選，2周后細胞克隆形成，其陽性克隆在0．5g/L的G418維持劑量壓力下繼續擴大培養2周備用。

1．2．4 ELISA檢測被轉染rADSCs上清中VEGF濃度：各組rADSCs在培養24h后收集培養上清，用ELISA試劑盒檢測培養上清中VEGF濃度，以平均pmol／1×10⁶細胞／48h(x±s，n＝4)表示。

1．2．5被轉染rADSCs的標記：在傳代后的細胞培養液中加入新鮮配制的Brdu，終濃度5μg/m1，至細胞生長到95％以上融合后備用。接種在12孔板中的rADSCs在用Brdu標記后經抗Brdu單抗進行免疫細胞化學染色，隨機觀察5個視野并計數。

1．2．6動物實驗：消化收集標記Brdu的rADSCs并臺盼藍染色記數為1×107⁷／ml，用D-Hank’s液反復3次洗滌，制成2ml的rADSCs的單細胞懸液用于注射動物模型。在大鼠背部一側制備直徑8×2．5cm的背部隨意型皮瓣模型，掀起皮辦后保留皮下的肉膜。實驗組有10只大鼠，在每只大鼠腹腔內注射2ml被轉染的rADSCs單細胞懸液，對照組有8只大鼠，在每只大鼠腹腔內注射2ml被空載體pcDNA3．1(一)轉染的rADSCs單細胞懸液。分別于術后7天用透明紙描記法記錄皮瓣成活范圍，用數坐標紙格子數的方法計算成活面積并換算為成活百分率。術后3天在皮辦遠端切取全層皮膚組織標本并用4％的多聚甲醛固定1h，然后用80％到100％的系列梯度的乙醇脫水，石蠟包埋后切片，行HE染色和抗Brdu免疫組化染色。

1．2．7統計分析：數據用x±s表示，t檢驗。

2 結果

2．1 rADSCs的分離和培養以及鑒定：原代培養的rADSCs在貼壁后細胞形態均一，呈梭形的單層成纖維細胞樣。流式細胞學檢查示第3代rADSCs均一性較好，CD49天陽性率為95．3％。

2．2細胞轉染與篩選效果：經轉染和G418篩選后，非轉染組的和pcDNA3．1(一)空載體轉染組的細胞100％死亡，而pcDNA3．1－VEGFl65重組質粒轉染組的細胞在篩選約2周后有數量較多的細胞集落，提示克隆化基因的細胞轉染及G418篩選效果良好。

2．3 ELISA檢測轉染后細胞上清中VEGF濃度

2．4動物實驗中大白鼠在手術后生命體征平穩，精神好，進食和飲水均好。術后7天，各組皮瓣的成活面積如下(表3、圖1)，術后3天皮瓣遠端皮膚組織抗Brdu免疫組化染色(圖2)。

3 討論

脂肪組織的基質成分中含有具有自我更新和多能分化潛能的脂肪干細胞(adipose derived stemcells，ADSCs)，我們以往的研究結果表明脂肪組織可以促進皮膚創面的愈合。由于脂肪組織來源廣泛，取材方便，可以獲得的基質細胞數量大，所以可以作為替換MSC來源的成體干細胞。ADSCs和MSC之間CD標記的區別是ADSCs表達CD49天，本實驗通過流式細胞學對培養的rADSCs表面抗原CD49天陽性的檢測確證和鑒定了培養的細胞是ADSCs。

pcDNA3．1－VEGFl65重組質粒轉染組的細胞經G418篩選后出現數量較多的細胞集落，而非轉染組的細胞100％死亡，提示VEGF基因轉染細胞的效果和G418篩選細胞的效果都良好。ELISA檢測轉染后細胞上清中VEGFl65濃度隨時間而升高，而非轉染組和pcDNA3．1(一)空載體轉染組的細胞上清中VEGFl65濃度較低，提示VEGF165在rADSCs中有效表達，并被正確修飾，rADSCs可以作為基因治療中的載體細胞。因此，理論上可以將獲得的穩定表達VEGF165的rADSCs移植到體內實施基因治療。

Brdu是常用的一種標記細胞核的熒光染料。注入到腹腔的被轉染rADSCs的Brdu標記細胞陽性效率可達70％以上，臺酚藍染色記數注入到腹腔rADSCs為1×10⁷，較高的Brdu標記率和充足的細胞數量是rADSCs在本移植實驗研究中作為皮瓣基因治療載體細胞的前提。

隨意型皮瓣是常用于研究皮瓣成活能力的模型。本實驗選用大鼠背部的8cm×2．5cm隨意型皮瓣模型，皮瓣遠端由于超出長：寬＝1：1．5的比值范圍，因而是血流供應較少的部位，在手術后局部出現血流緩慢，內皮細胞缺氧脫落和血栓形成等一系列的病理生理學改變，最終導致遠端超出血流供應范圍皮辦的缺血壞死。本研究結果表明，實驗組皮瓣的成活面積(59．6±0．52)％，大于對照組的皮辦成活面積(40．5±0．27)％，P<0．01，差異有統計學意義，說明被轉染的rADSCs可以通過分泌VEGF165促進隨意型皮瓣的成活。

標本Brdu免疫組化染色結果顯示注入到大鼠腹腔的rADSCs在術后3天即可以見到通過血液循環到達背部皮瓣遠端的皮下脂肪組織，術后5天、7天有類似的結果，這提示我們注入到大鼠腹腔的rADSCs具有早期向遠離注射部位的皮瓣遷移的生物學特點，提示rADSCs可以作為運送VEGF基因到達皮瓣的載體，并通過旁分泌作用釋放VEGF165促進側支循環的建立和血管的再生，改善皮瓣組織的血供。提示rADSCs作為運送治療基因的載體細胞提高皮瓣成活的可能性。

編輯／張惠娟

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