菠蘿葉基愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚

摘 要：以菠蘿[Ananas conosus(L.)Merr.]吸芽上的葉基部組織為材料，研究了2，4-D、NAA、BA、TDZ在菠蘿愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚過程中的影響。結(jié)果表明，2，4-D在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中起著極為重要的作用，其適宜濃度為5mg/L，適當(dāng)濃度(1mg/L)的BA在降低畸形胚比例和增加體細(xì)胞胚發(fā)生率方面有重要作用，但BA也會促進(jìn)愈傷組織分化不定芽；低濃度的TDZ與BA效果相似，在不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)處理組合中，MS+0.01ms/LTDZ+5mg/L2，4-D培養(yǎng)基的體細(xì)胞胚發(fā)生率最高(97％)。低濃度NAA(2～5mg/L)利于非胚性愈傷組織的增殖，而高濃度的NAA雖能促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)生，但這種體細(xì)胞胚很難繼續(xù)增殖，在萌發(fā)時只生根不發(fā)芽。成熟體細(xì)胞胚在MS+0.2％活性炭上30d時的轉(zhuǎn)株率為22.7％。

關(guān)鍵詞：菠蘿；愈傷組織；體細(xì)胞胚

中圖分類號：S668.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－59－05

菠蘿是世界三大熱帶果樹之一，也是我國主要熱帶果樹之一。自20世紀(jì)70年代以來，國內(nèi)外許多學(xué)者對菠蘿離體培養(yǎng)經(jīng)器官發(fā)生途徑再生植株開展了廣泛的研究，而通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑得到菠蘿再生植株的研究則是最近幾年才開始。Sripaoraya等首次用毒莠定(picjoram)從Phuket種的離體培養(yǎng)無菌苗葉片經(jīng)胚性愈傷組織誘導(dǎo)得到了體細(xì)胞胚，其體細(xì)胞發(fā)生率為58％；FiroozabadY等以Smooth Cayenne的無菌苗為材料，采用毒莠定與賽苯隆(Thidiazuron)組合比較了不同培養(yǎng)條件及愈傷組織形態(tài)對體細(xì)胞胚發(fā)生的影響，使體細(xì)胞胚發(fā)生率亦在55％左右。但這些研究報道均以無菌苗為誘導(dǎo)材料和使用非常用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，體細(xì)胞胚發(fā)生率也較低，且未見對體細(xì)胞胚進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)分析。國內(nèi)迄今尚未見對菠蘿的體細(xì)胞胚發(fā)生的研究報道。本研究以廣東菠蘿主栽品種之一神灣吸芽葉基為材料，使用2.4-D、BA、NAA等常用植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及其他培養(yǎng)基附加成分對菠蘿體細(xì)胞胚發(fā)生過程、形成規(guī)律及其組織細(xì)胞學(xué)的鑒定等方面進(jìn)行了的探索，希望以此建立起簡單、高效的菠蘿體細(xì)胞胚誘導(dǎo)系統(tǒng)，為菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化和低成本快速繁殖等提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1．1 材料

供試菠蘿品種為神灣，采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院園藝場。

1．2 方法

1．2．1 愈傷組織誘導(dǎo)和增殖 在晴天采下莖基粗0.5cm以上、發(fā)育正常的吸芽帶回實驗室，將衰老葉片從基部完全剝除，用自來水將吸芽沖洗干凈，離吸芽生長點(diǎn)上方約0.5cm處切斷所有葉片。將吸芽先以2％NaClO預(yù)消毒10min，無菌水沖洗3次；再以0.1％HgCl消毒8min，無菌水沖洗3次；以稍帶部分吸芽組織的形式切取每片著生在吸芽上的白色葉基，并將該葉基以0.1％HgCl消毒5min，無菌水沖洗3次，接種在MS+2.0mg/L BA+2.5mg/L NAA上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，4周后切下愈傷組織轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基(MS+3mg/L BA+2mg/L NAA)，每3周進(jìn)行1次繼代培養(yǎng)。

1．2．2 體細(xì)胞胚的發(fā)生與萌發(fā) 取增殖培養(yǎng)上的愈傷組織，切成約3mm×3min×3mm(長×寬×厚)大小接種于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種8塊愈傷組織，重復(fù)6次，在黑暗條件下培養(yǎng)40d，統(tǒng)計體細(xì)胞胚發(fā)生率、體細(xì)胞胚發(fā)生量和不定芽發(fā)生情況等。挑取愈傷組織表面的體細(xì)胞胚分別置于無激素MS上，培養(yǎng)30d后，觀察體細(xì)胞發(fā)育情況并統(tǒng)計體細(xì)胞胚萌發(fā)率。

1．2．3 組織形態(tài)學(xué)觀察 將材料浸于FAA中固定24h，按常規(guī)石蠟切片法制片，用番紅一蘇木精對染。切片在Mitotic B1 Series雙筒顯微鏡觀察拍照。體細(xì)胞胚等的表面形態(tài)在Mitotic ZM 140 Series雙筒體視鏡下觀察拍照。

1．2．4 培養(yǎng)條件 本實驗所有培養(yǎng)基均以MS(Murashige and Skoog，1962)為基本培養(yǎng)基，除另有注明外，還添加有3％蔗糖、7g/L瓊脂(固體培養(yǎng)基)，pH5.8。非胚性愈傷組織的保持增殖及體細(xì)胞胚的轉(zhuǎn)株均在16h光周期(30μmol/m²·s)、(27±2)℃條件下培養(yǎng)，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)則在暗環(huán)境下進(jìn)行。

1．2．5 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計 在培養(yǎng)后30d統(tǒng)計觀察誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚的外植體數(shù)量、生成的體細(xì)胞胚數(shù)量、培養(yǎng)物質(zhì)量、體細(xì)胞胚的生長狀況及形態(tài)，對體細(xì)胞胚發(fā)生率和發(fā)生量用SAS軟件ANOVA過程語句進(jìn)行差分析，對差異顯著的處理用Student-Newman-Keuls(SNK)法進(jìn)行多重比較。對培養(yǎng)基添加物的影響則設(shè)置不同激素水平的區(qū)組進(jìn)行對照實驗。體細(xì)胞胚質(zhì)量的測定則隨機(jī)抽取誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚在無激素的MS培養(yǎng)基上觀察萌發(fā)或增殖狀況。

2 結(jié)果與分析

2．1 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

在以菠蘿吸芽葉基愈傷組織為起始材料進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中，2，4-D起著極為重要的作用。在MS+1ms/L BA培養(yǎng)基中，通過比較從1mg/L到11mg/L 2，4-D不同濃度梯度對體細(xì)胞胚發(fā)生率及其質(zhì)量的影響發(fā)現(xiàn)，2，4-D最佳濃度為5mg/L，發(fā)生率可達(dá)73％，每g愈傷組織可形成約39體細(xì)胞胚(表1)。2，4-D濃度低于5mg/L時體細(xì)胞胚的發(fā)生率和發(fā)生量又會顯著降低；2，4-D濃度在7～11mg/L時體細(xì)胞胚的發(fā)生率和發(fā)生量比5 mg/L時不僅無顯著增加，而且隨著2，4-D濃度增加，愈傷組織褐化逐漸加重，畸形胚比率大幅增加，在2，4-D濃度達(dá)到或超過11mg/L時產(chǎn)生的體細(xì)胞胚已不能萌發(fā)。

BA對愈傷組織的體細(xì)胞胚發(fā)生的影響見表2。MS+5mg/L 2，4-D培養(yǎng)基中不添加BA時，愈傷組織褐化非常嚴(yán)重，誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚中畸形胚比率增加，此時約有1/3的球形胚是先長出胚根，而這些只有胚根的體細(xì)胞胚將不能繼續(xù)分化出胚芽。加入BA后，體細(xì)胞胚的發(fā)生率和發(fā)生量會明顯增加，體細(xì)胞胚的體積增大也比較明顯，尤以1mg/LBA的效果最佳。但BA的存在也會同時促進(jìn)愈傷組織分化不定芽，影響體細(xì)胞胚發(fā)生的專一性。

用低濃度的TDZ代替BA作為細(xì)胞分裂素配合高濃度的2，4-D后，其體細(xì)胞胚發(fā)生率和每g愈傷組織形成的體細(xì)胞胚數(shù)量與使用BA時無明顯差異，TDZ的最適濃度為0.01mg/L(表3)。但萌發(fā)檢測表明，TDZ與2，4-D組合誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚在無激素培養(yǎng)基上呈綠色，體積較大，生活力強(qiáng)。

實驗結(jié)果還顯示，NAA在低濃度(2～5mg/L)時，利于非胚性愈傷組織的增殖。很少有體細(xì)胞胚發(fā)生，在MS+Img/L BA+2～5mg/L NAA培養(yǎng)基中的體細(xì)胞胚發(fā)生率只有3％～10％。但高濃度的NAA能促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)生，當(dāng)NAA濃度達(dá)到10mg/L時，體細(xì)胞胚發(fā)生率也能達(dá)到82.4％。此時用0.1mg/LTDZ代替1mg/L BA，體細(xì)胞胚發(fā)生率沒有明顯差異，但這種高濃度NAA得到的體細(xì)胞胚多為畸形胚，很難繼續(xù)增殖，且在萌發(fā)時只生根不發(fā)芽(表3)。

2．2 體細(xì)胞胚的增殖

比較MS+2mg/L 2，4-D+1mg/L BA的固體和液體培養(yǎng)基對體細(xì)胞胚增殖的影響時發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)基的增殖效果明顯不如液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)2個月后，固體培養(yǎng)基的平均增殖系數(shù)3.59，而液體培養(yǎng)基的平均增殖系數(shù)為5.04。在液體增殖培養(yǎng)中，需要及時將萌發(fā)的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移出，否則所有的體細(xì)胞胚將快速轉(zhuǎn)向萌發(fā)。

2．3 體細(xì)胞胚的萌發(fā)

將成熟體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入MS基本培養(yǎng)上，約20d培養(yǎng)開始逐漸萌發(fā)成幼小植株，30d時轉(zhuǎn)株率為8.7％。MS基本培養(yǎng)基中添加0.2％活性炭對體細(xì)胞胚增殖及萌發(fā)的效果都明顯增加，在30d時轉(zhuǎn)株率為22.7％，同時也會促進(jìn)次級胚形成，次級胚形成量為初生胚的2.04倍。椰乳會抑制體細(xì)胞胚的萌發(fā)而促進(jìn)其產(chǎn)生次生胚，添加了椰乳(5％，v/v)的培養(yǎng)基平均體細(xì)胞胚萌發(fā)率僅為MS基本培養(yǎng)基的74％，次級胚形成量為初生胚的2.3倍。

2．4 體細(xì)胞胚的形態(tài)組織學(xué)觀察

體細(xì)胞胚發(fā)生初期通過胚柄與母體相連，發(fā)生后期胚柄細(xì)胞死亡，體細(xì)胞胚與母體植物間形成明顯的生理隔離(圖版-A、B)。體細(xì)胞胚的成熟和萌發(fā)與其他單子葉植物合子胚發(fā)育類似，都會經(jīng)過一個較長的球形胚期，然后胚逐漸變橢圓，一側(cè)出現(xiàn)缺刻。缺刻把初葉原基與莖尖部分分開(圖版-C)，然-后胚軸延長，胚呈棒狀，胚芽鞘出現(xiàn)并分開，之后初葉展開，莖尖和胚根上下延伸(圖版E)，多葉片輪狀交替發(fā)生(圖版-G、H)。在液體懸浮培養(yǎng)中，體細(xì)-胞胚萌發(fā)的同時，往往會在胚芽鞘附近分化出次生胚(圖版G、H)。過于密集的次生胚阻礙了根的形成，如果不及時分開已經(jīng)開始萌發(fā)的胚，會不利于轉(zhuǎn)株。在液體懸浮增殖培養(yǎng)基中，由于生長素濃度降低或缺失，體細(xì)胞胚會進(jìn)一步完成發(fā)育的全過程直至萌發(fā)。體細(xì)胞胚萌發(fā)大都不均一，而且一個體細(xì)胞胚團(tuán)一旦發(fā)生萌發(fā)，新生的次生胚一般都會相繼進(jìn)入成熟和萌發(fā)期，而不繼續(xù)增殖，經(jīng)過一段時間后，可以明顯地看到增殖和萌發(fā)的區(qū)隔化(圖版-F)。

3 討 論

眾所周知，2，4-D是誘導(dǎo)體細(xì)胞體發(fā)生的重要因素，為香蕉、水稻和香根草等多種單子葉植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)所必需的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，且使用2，4-D時需要保持較高濃度。本研究表明，一定濃度范圍內(nèi)的2，4-D和NAA 2種生長素類物質(zhì)都能誘導(dǎo)菠蘿吸芽葉基愈傷組織產(chǎn)生體細(xì)胞胚，但從體細(xì)胞胚的發(fā)生率和質(zhì)量比較來看，2，4-D的效果顯著優(yōu)于NAA。適宜的2，4-D濃度是提高體細(xì)胞胚發(fā)生率和質(zhì)量的關(guān)鍵因素。尤其是當(dāng)2，4-D濃度控制在5mg/L左右時，對體細(xì)胞胚高頻發(fā)生起更加顯著的促進(jìn)作用。2，4-D作為一種信號物質(zhì)和脅迫劑。通過多種機(jī)制改變植物細(xì)胞的發(fā)育程序。如通過基因組甲基化改變基因表達(dá)，激活控制細(xì)胞分裂的細(xì)胞周期蛋白基因，改變細(xì)胞內(nèi)源激素代謝和生物合成等。但2，4-D在誘導(dǎo)菠蘿體細(xì)胞胚發(fā)生機(jī)理方面還有待進(jìn)一步探討。

在本研究中還發(fā)現(xiàn)，菠蘿愈傷組織一旦進(jìn)入分化狀態(tài)，即使轉(zhuǎn)入無生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS基本培養(yǎng)基中，仍會分化出不定芽。在菠蘿及鳳梨科其他種類的組織培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素BA是促進(jìn)不定芽分化的最關(guān)鍵的因素。在菠蘿體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中，如果培養(yǎng)基中沒有BA，愈傷組織褐化程度會顯著增加，得到的體細(xì)胞胚生活力低；而較低濃度的BA(0.5～1mg/L)與較高濃度2，4-D的組合有利于降低不定芽分化及其對體細(xì)胞胚發(fā)生的干擾；BA濃度超過1mg/L，則會有大量不定芽產(chǎn)生而使體細(xì)胞胚發(fā)生率和發(fā)生量降低。因此，在誘導(dǎo)菠蘿愈傷組織產(chǎn)生體細(xì)胞胚的過程中，如何通過避免不定芽分化保證體細(xì)胞胚發(fā)生的專一性，仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究表明2，4-D是提高體細(xì)胞胚發(fā)生率的關(guān)鍵因素。菠蘿吸芽葉基產(chǎn)生的愈傷組織在MS基本培養(yǎng)基中，添加5mg/L2，4-D和1mg/LBA經(jīng)60d培養(yǎng)，可誘導(dǎo)出大量體細(xì)胞胚，其發(fā)生率可穩(wěn)定在95％以上；體細(xì)胞胚在較低濃度2，4-D的液體培養(yǎng)基中能獲得有效增殖，將成熟體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入無生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS基本培養(yǎng)基中會萌發(fā)成株。利用2.4-D和BA等常規(guī)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)所建立體細(xì)胞胚發(fā)生系統(tǒng)為簡單、高效獲得菠蘿體細(xì)胞胚提供了一條有效途徑。

作者簡介：何業(yè)華，男，教授，主要從事果樹生物技術(shù)方面的研究。