不同培養條件對幸香草莓離體葉片再生的影響

摘 要：以草莓品種幸香葉片為外植體，研究了葉齡、暗培養、不同顏色的濾光膜、AgNO₃、不同激素配比等對葉片再生不定芽的影響，建立了高效再生體系。結果表明，5周的葉齡、暗培養5～6周、附加AgNO₃1.0～40mg/L利于不定芽的分化；不同顏色濾光膜對草莓分化不定芽的效應不同，紅膜、黃膜、綠膜能顯著提高再生頻率，紅膜處理能濾去紫外光、藍紫光、綠光，再生頻率達最大，藍膜對再生頻率無影響，紫膜對再生頻率起顯著抑制作用；MS+TDZ4.0mg/L+NAA0.1mg/L暗培養6周最適于不定芽分化，再生頻率達98.9％，平均再生不定芽3.8個。

關鍵詞：草莓：葉片；不定芽；再生；光質

中圖分類號：S668.4 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－105－04

草莓葉片離體再生技術是進行草莓遺傳轉化和化學誘變突變體離體篩選的基礎技術，高效、穩定的再生系統是此類工作的前提。草莓葉片離體再生已有很多文獻報道。研究內容涉及影響再生的各種相關因子，其中試材的基因型是決定再生頻率高低的重要因子之一。草莓品種幸香是由豐香與愛莓雜交育成的，品質優良，在我國栽培面積逐步擴大，但抗病性差，特別是不抗白粉病。有報道顯示豐香品種再生能力弱，但通過培養條件的改進已建立了高效再生體系，作為其后代的幸香品種再生能力如何尚未見報道。本文研究了葉齡、暗培養、光質、AZNO₃，、不同激素組合等影響幸香草莓葉片離體再生的因素，建立了再生體系，為進行遺傳轉化和誘變育種突變體離體篩選提供技術依據。

1 材料和方法

1．1 材料

供試材料為幸香草莓試管苗，由本實驗室保存，試管苗的繼代培養基為MS+BA 0.5mg/L+IBA0.1mg/L。

1．2 方法

實驗時選取生長一致的植株，剪取部位、大小一致的葉片，去葉緣和葉尖，切成0.2cm×0.2cm的葉塊，近軸面向下與培養基接觸進行培養。每處理接種10～15個外植體，重復8次，2周重新繼代1次。葉片再生以MS為基本培養基，蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照2000lx，16h/d，溫度(24±1)℃。

研究葉齡、暗處理、濾光膜、AgNO₃對葉片再生的影響，培養基為MS+TDZ4.0mg/L+IAA 0.1mg/L。濾光膜處理時將接種葉盤的培養皿覆蓋于不同顏色(紅、綠、藍、黃、紫)的濾光膜中，置于光下培養，以熒光燈下培養為對照。用法國Secomam公司的Anthelie advanced 2型紫外/可見分光光度計掃描測定200～900nm濾光膜的透光率。各處理在培養70d后調查外植體不定芽再生頻率和再生芽數。

2 結果與分析

2．1 葉齡對葉片再生不定芽的影響

表1結果表明，葉齡35d以內的葉片再生能力隨葉齡的增大而提高，但14d以內的幼嫩葉片不利于葉片再生，因此幸香草莓葉片再生選擇5周齡的葉片較為合適。5周齡以上的葉片本實驗未做處理，再生能力如何需重新實驗驗證，前人報道葉齡超過一定值后再生能力有所降低。

2．2 暗處理對葉片再生不定芽的影響

暗處理能顯著提高幸香草莓葉片的再生率，促進了不定芽的分化(表2)。當一直進行光培養時，再生頻率僅為16.3％，隨暗處理時間的延長再生頻率呈現逐漸增長的趨勢，當暗處理時間為6周時再生頻率達到最大值(81.3％)，延長至7周時再生能力有所下降。

2．3 不同顏色的濾光膜對葉片再生不定芽的影響

測定了不同顏色濾光膜在200～900nm的透光值(圖1)。在紫外光波段(300～400nm)，紅膜透光值最低，峰值僅為2.3％，其次是黃膜，透光值峰值為11.9％，綠膜、藍膜、紫膜透光值峰值分別為43.1％、59.4％、56.4％。在可見光波段(400～780nm)，紅膜透光值在610nm開始上升，670nm達到峰值，說明紅膜能濾去紫外光、藍紫光(400～510nm)、綠光(510～610nm)，而紅橙光及遠紅光(610～900nm)則能較多地透過。黃膜在450～580nm透光值逐漸上升并維持在較高水平。綠膜在580nm處有另一峰值而不同于其他色膜。藍膜和紫膜的透光值變化趨勢相似，對紫外光和藍紫光都有較大的透光值。

試驗中使用的濾光膜處理中，紅膜、黃膜、綠膜對葉片不定芽的分化起促進作用(表3)，以紅膜效果最好，再生頻率極顯著高于對照，藍膜處理的再生頻率接近于對照，而紫膜處理的再生頻率為0。各膜色處理對再生能力的影響與紫外光波段的透光值呈負相關，說明紫外光對葉片不定芽的分化起抑制作用。

2．4 AgNO₃對葉片再生不定芽的影響

葉片接種后暗處理2周再添加AgNO₃，繼續暗處理4周后轉入光下培養。由表4可以看出。當AgNO₃濃度范圍在1.0～4.0mg/L時，對再生能力有顯著促進作用，并且隨著濃度的增大效果越明顯，以濃度為4.0mg/L時再生頻率最大，但各濃度間無顯著性差異。當濃度增大到8.0mg/L時則極顯著抑制了再生。

2．5 不同激素配比對葉片再生的影響

MS培養基中附加不同濃度的TDZ、IAA、IBA、NAA和2，4-D，暗處理6周后轉入光下培養。當不同濃度的TDZ附加于0.1mg/L IAA時，TDZ濃度在2.0～6.0mg/L內葉片再生頻率無顯著性差異，均超過80％，當TDZ濃度過低(1.0mg/L)和過高(8.0mg/)時，再生能力均有所降低(表5)。

在TDZ 4.0mg/L時，生長素種類和濃度對草莓葉片再生不定芽有顯著影響(圖2)。在濃度0.1～0.8mg/L范圍內IBA處理再生率先升后降，在0.4mg/L時最高為86.4％，而IAA處理再生率先降后升，在0.8mg/L時最高為84.6％，綜合來看，2者并無顯著差異。當NAA濃度為0.1、0.2mg/L時，葉片再生頻率均超過90％，尤其是前者，再生頻率高達98.9％，但隨NAA濃度的增大，再生能力有所下降。2，4-D濃度為0.1、0.2mg/L時愈傷組織分化出不定芽的時間在8周以上，且每葉片再生不定芽的密度較大，但濃度在0.4mg/L以上時未見有不定芽分化。另外將7DZ 4.0mg/L+NAA0.1mg/L處理置于光下培養，再生頻率為47.5％，每葉片再生不定芽數為2.2，明顯低于同等培養基暗處理6周后的再生頻率，但高于同等光照條件下附加IAA0.1mg/L時的處理。附加吲哚類生長素IAA、IBA的處理，不定芽發生較早。從第4周起即有不定芽出現，且萌發的新葉生長旺盛，而附加NAA和2，4-D的處理不定芽發生晚，前者從第6周起，后者至第8周起方有不定芽出現，且萌發的不定芽小而密，生長勢不如附加IAA、IBA的處理。

3 討 論

對于葉片發育狀態的選擇。多以繼代時間(或葉齡)為參考值，于冬梅等認為，草莓品種M14葉齡為21～28d的葉盤再生芽頻率最高，葉齡在30d以上，葉盤不定芽再生頻率普遍下降10％～15％。孫崇波等也認為草莓葉齡超過30d，再生能力有所降低。葉齡反應葉片的生理狀態，生長時間不同的葉片內源激素水平不同，因此對外源激素的反應不一樣。結合本實驗結果，幸香草莓葉片再生選擇5周齡的葉片較為合適。但由于在增殖培養的過程中培養基及培養的環境條件不同，不同品種試管苗的生長速度不同，故在實際應用中應通過實驗選擇適合再生的葉片葉齡。

較長時間的暗處理對幸香草莓葉片再生有顯著的促進作用，這與許多植物再生的研究報道一致，暗處理可減少外植體酚類物質的溢出，利于不定芽的分化。但也有前人報道草莓M14葉盤經暗培養處理后，不定芽再生頻率普遍下降，隨暗培養時間延長，葉盤再生頻率下降幅度增大。本實驗結果表明幸香草莓葉片是在第6周開始形成不定芽，因此暗處理到第6周再生頻率相對最高，再延長至7周則再生能力有所下降。暗培養對不同基因型草莓葉盤再生芽誘導的作用不同，對不易建立再生體系的基因型可選擇暗處理。由于暗培養的作用比較復雜，暗處理對外植體再生芽誘導的作用機制尚需進一步研究。

光質是植物生長發育的重要因子。對植物的形態建成、生理代謝、生長發育有廣泛的調節作用。紫外線是影響植物的生長生理活動的重要生態環境因子之一，紫外線輻射對植物生長發育有明顯的抑制作用。秦永華等，研究了不同有色膜對豐香草莓再生的影響，認為綠膜和紅膜對不定芽再生有明顯的促進作用，而藍膜和黃膜則不利于芽的分化，不同有色膜在300～700nm波長下的光強是影響不定芽分化的主要因素。本實驗結果與此基本一致，但相反的結果是黃膜促進了不定芽分化，可能是使用有色膜的色差，進而濾過的光強、光質不同所致。實驗同時增加了紫膜處理，并掃描測定了不同色膜的透光率，不同波長的透光率差異反映光質的不同。結果表明葉片的再生頻率與濾光膜在紫外光下的透光率相反，從一定程度上驗證了紫外光對葉片再生的傷害和阻礙作用。雖然紅膜處理仍不如暗處理對再生能力的提高效果好，但植物的生長發育仍需要光照，暗處理也不能無限制地延長，因此可考慮在轉入光下培養后覆蓋紅膜，消除紫外光的傷害，提高再生頻率。

AzNO₃作為乙烯合成的抑制劑，可有效地防止植物細胞在離體培養過程中由于乙烯的積累而對外植體生長和不定芽分化帶來的影響，并可顯著提高植株的再生頻率。但AgNO₃對草莓葉片離體再生的影響一直頗有爭議。宋國慶等認為AgNO₃有利于芽苗再生，在接種葉片前加入主要刺激芽苗的直接再生，而在愈傷組織形成后加入則主要提高再生頻率。但是在弗吉尼亞草莓植株上，Ag⁺不僅沒有促進再生，反而起到了抑制作用。對幸香草莓而言，一定濃度(1.0～4.0mg/L)的AgN03能促進不定芽再生。

在預備實驗中使用了細胞分裂素6-BA與/DZ作比較，但6-BA再生頻率極低，在幸香草莓葉片再生中不宜使用。TDZ作為一種植物生長調節劑，具有很強的細胞分裂素活性，本試驗結果表明TDZ在2.0～6.0mg/L范圍內再生頻率均超過80％。在生長素實驗中附加較低濃度(0.1～0.2mg/L)的NAA處理再生頻率比同濃度的IAA再生頻率高，而較高濃度(0.4～0.8mg/L)的NAA處理再生頻率比同濃度的IAA再生頻率低，可能原因主要是幸香草莓葉片對2者的敏感性不同。另外NAA在光下穩定而IAA在光下易分解，轉到光下培養后，NAA能持續對外植體起作用而IAA部分被分解。另外植株體內含有內源IAA，但不含NAA，添加NAA可能是2者共同作用的結果，比單一的IAA作用效果要好。NAA處理的再生頻率達到本實驗中的最大值98.9％(MS+TDZ4.0mg/L+NAA0.1mg/L)，且平均再生芽數為3.8個。將不定芽轉到MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L培養基上恢復生長，再轉到1/2MS+IBA 0.1mg/L培養基上生根成苗。

作者簡介：周厚成，男，助理研究員，碩士。