龍眼梅ＰＧＩＰ基因的克隆及序列分析

摘 要：利用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)得到在龍眼梅(Prunus mume Sieb et Zucc.Longyan)嫩芽中特異性表達的PGIP基因。DNA序列分析表明，所獲得龍眼梅的PGIP eDNA的序列全長為1045bp，該序列與已發(fā)表的PGIP基因有很高的同源性。

關(guān)鍵詞：龍眼梅；PGIP基因；克隆

中圖分類號：S662.4 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－55－04

龍眼梅(Prunus mume Sieb et Zucc.Longyan)是中國南方特產(chǎn)名果之一，其風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，藥用價值高，被譽為保健食品，深受國內(nèi)外消費者的喜愛。龍眼梅的果實因含酸量較高，很少用于鮮食。大部分用于加工，但由于果實采后迅速軟化，給貯運和加工帶來很大的困難，尤其是交通不便的山區(qū)。果實采收后，因果實的軟化，在加工前出現(xiàn)品質(zhì)下降，甚至大量腐爛，給生產(chǎn)帶來很大的經(jīng)濟損失。因此。選育出抗軟化和抗病蟲害的龍眼梅品種是急需解決的問題，也是解決龍眼梅果實軟化的主要途徑之一。

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonaseinhibiting protein.PGIP)是一種富含亮氨酸(LRR)的蛋白質(zhì)家族成員之一，能夠非競爭性地抑制多種植物病理性真菌的內(nèi)聚半乳糖醛酸酶(Polygalactur-onase，PGs)的酶活性，促進寡半乳糖醛酸酶的增加，抑制植物細胞壁果膠的溶解，增加植物的抗毒素，激活植物的防御系統(tǒng)。PGIP基因可以干擾灰霉菌等多種真菌病害對植物組織的侵染過程，從而抑制這些真菌病害的發(fā)生。PGIP基因還與果實的發(fā)育過程、脅迫反應(yīng)、冷藏、漿果果實的病蟲害等有一定關(guān)系。因而，PGIP基因受到國內(nèi)外研究者的高度重視并成為目前抗病蟲害基因工程和果實耐貯藏基因工程研究的焦點。

本文以龍眼梅嫩芽為材料，對其PGIP(cDNA)基因進行克隆和測序，為進一步開展轉(zhuǎn)基因育種工作奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料

植物材料龍眼梅嫩芽采自福建農(nóng)林大學(xué)校園，液氮速凍，放-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｗ灾拼竽c桿菌DH5α；載體pGEM^R-TEasy vector購于Promega公司；玻璃奶法回收片段試劑盒購于北京原平皓公司。由上海生工生物工程公司測序。

1．2 方法

1．2．1 總RNA的提取及純化 總RNA的提取采用Trizol提取試劑盒。

1．2．2 基因組RNA含量和純度的測定 取2μL基因組RNA樣品稀釋50倍，在Ultrospec 2100 Pro紫外分析儀上測定D_260nm、D_280nm、D_260nm／D_280nm、RNA含量(μg/μL)。

1．2．3 基因組RNA的電泳分析 取5μL RNA樣品在1.0％瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液為1×TAE，電壓為120V的條件下電泳20min，溴化乙錠染色，在凝膠成像儀上觀察DNA分子的大小、完整性、電泳條帶的清晰度。

1．2．4 cDNA第1鏈的合成 cDNA第1鏈合成采用MBI Fermentas公司試劑盒，具體操作步驟參照使用說明書。

1．2．5 RT-PCR反應(yīng)體系及程序 1)引物的選用與合成參照張開春等和張軍科等的馬哈利櫻桃PGIP的序列合成一對引物，其上游引物為5-CGTTCACC CGCAATCACATlq'CTTATCC-3：下游引物為5-TGG CCGTGGGAATTATTFGCAGC-3；引物由上海生物工程公司合成。2)PCR反應(yīng)體系為20μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer(plus)2.0μL，dNTP(10mmoL/L)0.3μL，MgCl₂(25mmoL/L)0.3μL，TAQ(2.5μ/L)0.5μL，cDNA 1.0μL或cDNA25.0ng，上游引物(10μm/mL)0.6μL，下游引物(10μm/mL)0.6μL，ddH₂O 14.7μL。擴增程序為：預(yù)變性95℃ 5min；94℃ 1min；60℃ 1min；72℃ 1min循環(huán)35次；72℃10min；4℃保存。3)電泳檢測：同RNA電泳檢測過程。

1．2．6 目的片段回收與克隆 PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳分析后，用玻璃奶法回收片段(操作步驟見北京原平皓公司產(chǎn)品說明書)，以pGEM-T-Easy為克隆載體，16℃連接過夜，后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，在加Amp的選擇性培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選，挑取白色菌落，搖菌并做菌液PCR，進行初步鑒定后測序。

2 結(jié)果與分析

2．1 總RNA的提取

取2μL在紫外分光光度計上測其含量，得結(jié)原如下：D_230nm=0.110，D_260nm=0.221，D_280nm=0.122，D_260nm/D_230nm=2.14，D_260nm/D_280nm=1.81，濃度為2.13μg/μL。總RNA電泳后在凝膠成像儀上拍照結(jié)果如圖1。

2．2 龍眼梅cDNA的PGIP片段的獲得

以上、下游引物對龍眼梅的cDNA進行擴增，得到一條1045bp特異條帶，條帶清晰(圖2)。

龍眼梅cDNA的PGIP基因全序列的拼接結(jié)果如下：

2．3 龍眼梅cDNA的PGIP基因編碼蛋白質(zhì)序列的推導(dǎo)

用該引物獲得龍眼梅的氨基酸序列全長330aa，起始密碼子是AUG，終止密碼于是UAA，分子量為36.7ku。

2．4 龍眼梅cDNA的PGIP基因編碼蛋白質(zhì)序列的Blast結(jié)果

通過Blast，發(fā)現(xiàn)用所獲得的龍眼梅PGIP基因可能編碼的氨基酸與其他物種的PGIP基因編碼的氨基酸相似系數(shù)較高，其相似系數(shù)分別為：與馬哈利櫻桃(只mahaleb)、杏(只dulcis)、雞麻(只hodotyposscandens)達91％；與山杏(P.armeniaca)、羽葉鐵樹(Lyonothamnus floribundus)、華空木(Stephanandrachinensis)達90％；與蘋果(Malus domestica)達83％；與砂梨(Pyrus pyrifolia)、西洋梨(p.communis)達82％：與巨桉(Eucalyptus grandis)達81％、與柳葉桉(Eucalyptus saligna)達86％；與月果桉(Zucalyptusnitens)、赤桉(E.camaldulensis)達85％；與柑橘類(Citrus sp.cv.Sainumphung、C.jambhiri、C.iyo、C.unshiu、C.latipes 、C.sinensis、C.hystrix、C.aurantiifo-lia)、懸鉤子(Rubus idaeus)等達75％；與歐亞種葡萄(yitis vinifera)達71％；與棣棠花(Kerria japonica)達88％。

3 討 論

果實的軟化與多聚半乳糖醛酸酶(PC)活性的增強直接相關(guān)，研究認為在蘋果、桃、柑橘、番茄、香蕉等果實成熟軟化中主要是PG起作用。通過PG的反義RNA技術(shù)，可有效抑制果實的軟化，但乙烯、果膠酯酶等活性并未受到任何影響，果實仍然正常成熟，沒有象預(yù)期的那樣推遲軟化或減少軟化程度。真菌侵染植物時，往往會釋放PG，使植物細胞壁遭到破壞，植物則相應(yīng)產(chǎn)生PGlP來抑制PG酶的活性。針對轉(zhuǎn)PG反義基因的缺點，考慮到PGIP能夠非競爭性地抑制多種植物病理性真菌的內(nèi)聚半乳糖醛酸酶的活性，促進寡半乳糖醛酸酶的增加，抑制植物細胞壁果膠的溶解，增加植物的抗毒素。激活植物的防御系統(tǒng)。許多研究者探索新的抑制果實軟化和抵抗真菌侵染的途徑，即從植物體中分離PGIP(多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)基因，構(gòu)建植物表達載體使PGIP基因在轉(zhuǎn)基因植物中過量表達。從而抑制PG活性推遲果實的軟化和增強植物防御系統(tǒng)。

為了能進一步驗證所克隆的序列是我們所需的目的基因，需要進行基因的功能鑒定，首要的是把我們的目的基因?qū)胫参镏校灾参餅槭荏w來進一步驗證此基因是否可以使果實耐貯藏。

4 結(jié) 論

通過龍眼梅的定向克隆引物和其PCR擴增體系的建立，成功克隆了龍眼梅的PGIP基因，該基因的序列全長1045bp，具有一個完整的開放讀碼框架(由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開始，到終止密碼為止的一個編碼序列)。把所得到的序列與其它物種的序列進行比較，發(fā)現(xiàn)龍眼梅與其他物種的相似性較高(70％～90％)，從進化角度看，龍眼梅的進化相對較保守，尤其與馬哈利櫻桃(P.mahaleb)、杏(只dulcis)、雞麻(R.scandens)的相似系數(shù)達91％，初步證明我們所克隆的片段為PGIP基因，以便今后以此作為目的基因構(gòu)建表達載體，為進一步進行轉(zhuǎn)基因育種工作奠定了基礎(chǔ)。

作者簡介：王家福，男，研究員。主要從事園藝植物生物技術(shù)研究。