鈣果４號歐李組織培養(yǎng)技術(shù)研究

摘 要：以鈣果4號歐李秋季生長的幼嫩上部枝和春季萌生的幼嫩基生枝為材料，利用正交試驗設(shè)計等方法研究了歐李組織培養(yǎng)的最佳基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑配比。結(jié)果表明，以春季萌生的幼嫩基生枝為外植體材料較好，以70％～75％酒精浸洗10～30s后用0.1％升汞浸洗6min消毒效果最好，適宜芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是改良MS+NAA0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，最佳芽增殖培養(yǎng)基是改良MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.02mg/L+GA₃0.2mg/L+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，適宜生根培養(yǎng)基是1/2MS+IBA1.0mg/L+KT0.02mg/L+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂。

關(guān)鍵詞：歐李；組織培養(yǎng)：正交試驗

中圖分類號：S662.3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－80－04

歐李(Cerasus lumilis Bunge)為薔薇科李亞科櫻桃屬落葉小灌木，是我國特有的一個古老的野生果樹。其鮮果鈣含量高達3.6mg/g，俗稱為“鈣果”。歐李的常規(guī)繁殖多采用扦插和分株等方法，受外界環(huán)境條件影響較大，繁殖系數(shù)較低。自錢國珍等利用歐李實生苗進行組織培養(yǎng)研究獲得成功以來，趙玉軍等也對實生苗快繁技術(shù)進行了報道，鐘士傳等對其進行研究時均沒有具體指出所用材料為何品種；莊麗娟等以“優(yōu)質(zhì)大歐李”、任清盛以“中華鈣果”為材料進行了研究，然而，他們對外植體消毒研究不夠深入，雖然也找到了歐李芽增殖的培養(yǎng)基配方，但芽增殖率不高(最高為6.9)。由于試材基因型、外植體類型及其生理狀態(tài)對植物生長調(diào)節(jié)劑敏感程度不同，外植體高效再生成苗也相應(yīng)存在差異，適宜培養(yǎng)基的篩選確定成為歐李組織培養(yǎng)技術(shù)中的第一步。本試驗以歐李新品種鈣果4號為材料，利用正交試驗方法進行組織培養(yǎng)技術(shù)研究，深入研究外植體選擇與消毒方法，篩選適宜的芽誘導(dǎo)、芽增殖和生根培養(yǎng)基，以建立鈣果4號的組培體系。

1 材料和方法

1．1 材料

供試材料是2003年由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進的歐李優(yōu)良品種鈣果4號苗木，栽植于庭院。2004年10月下旬和2005年4月初，分別選用幼嫩上部枝和幼嫩基生枝為外植體進行培養(yǎng)。

1．2 方法

1．2．1 外植體無菌體系建立 將從田間剪取的幼嫩上部枝或基生枝去葉留莖，放于清水中沖洗30min左右，用洗潔精溶液洗滌后，再用流水緩慢沖洗2～4h，蒸餾水漂洗數(shù)次帶人無菌操作室，放入70％～75％的酒精中浸洗10～30s后，迅速用無菌水漂洗2～3次；然后用0.1％的升汞分別浸洗6、9、12min，無菌水浸洗4～6次，最后用無菌紙吸干殘留水分，剪成1～2cm長莖段(含1～2個腋芽)，接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。20d后統(tǒng)計污染率、未萌芽率和存活率。試驗結(jié)果統(tǒng)計參考肖顯華等的方法，并作改動。污染率(％)=(污染外植體數(shù)／接種外植體數(shù))×100，未萌芽率(％)=[(死亡外植體數(shù)+未萌芽外植體數(shù))／接種外植體數(shù)]×100，存活率(％)=(萌芽不污染外植體數(shù)／接種外植體數(shù))×100。

1．2．2 芽誘導(dǎo) 芽誘導(dǎo)所用基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基與改良MS培養(yǎng)基(1/2大量元素+1/2微量元素+鐵鹽+有機物)，附加不同濃度的NAA與6-BA(表1)，培養(yǎng)基中添加20g/L的蔗糖和7g/L的瓊脂(下同)，培養(yǎng)基pH值(下同)5.6～6.0。培養(yǎng)條件(下同)為：溫度(25±2)℃，光照強度2000～3000lx，光照時間12～14h/d，培養(yǎng)室空氣相對濕度70％左右。

1．2．3 芽增殖試驗 以改良MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，進行3因素3水平正交設(shè)計(表2)。采用芽誘6min對外植體消毒滅菌效果最好(圖版－1)。

2．1．2 芽誘導(dǎo)情況 接種于1號培養(yǎng)基的上部枝莖段在第20天時，萌發(fā)的腋芽很少，在第30天，生長勢不佳；基生枝莖段在第20天時，單株萌發(fā)的腋芽有1～3個，在第30天，生長勢比前者好。而接種于2號培養(yǎng)基的上部枝莖段在第20天時，部分莖段腋芽已萌發(fā)，但顏色很淺，在第30天，已形成多個芽，但有的芽趨向白化，生長勢不好；基生枝莖段在第20天時，單株萌發(fā)的腋芽有2～4個，在第30天，生長勢一般。而接種于3號培養(yǎng)基上的幼嫩基生枝莖段在10d內(nèi)頂芽萌發(fā)，而有頂芽的莖段腋芽萌發(fā)不明導(dǎo)中生長一致，長度1～2cm含1～2個腋芽的莖段，接種于9組培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每組試驗做5次重復(fù)。芽增殖率(％)=最終芽的數(shù)量／最初芽的數(shù)量×100

1．2．4 不定根誘導(dǎo) 將芽增殖中生長一致，株高3～4cm、含莖尖的莖段接種于各種培養(yǎng)基上。30d后統(tǒng)計生根情況。

2 結(jié)果與分析

2．1 無菌體系建立與芽誘導(dǎo)試驗

2．1．1 外植體存活情況 由表3可以看出，鈣果4號歐李春季萌生的基生枝在0.1％升汞中浸洗6min的存活率最高，為83％；隨著在0.1％升汞中浸洗時間的延長，外植體的存活率減小，其中主要是未萌芽率在升高。在0.1％升汞中浸洗6min和9min的污染率均比較低，為17％。秋季上部枝在相同消毒時間下污染率明顯高于春季基生枝，且存活率明顯低于后者。可見以春季萌生的基生枝為外植體材料更好，以70％～75％酒精浸洗10～30s，0.1％升汞浸洗顯，在第20天時，單株萌發(fā)的腋芽不足3個，在第30天，不足8個，整個過程生長較慢；上部枝莖段在第20天時，單株萌發(fā)的腋芽2～3個，在第30天，3～5個。接種于4號培養(yǎng)基的幼嫩基生枝莖段在10 d內(nèi)頂芽與腋芽就開始萌發(fā)，然后迅速生長，在第20天時，萌發(fā)的腋芽有4個以上，在第30天，單株萌發(fā)的腋芽有5～10個，有的更多，并且這些芽的質(zhì)量都正常；上部枝莖段在第20天時，單株萌發(fā)的腋芽有3～4個，在第30天，單株萌發(fā)的腋芽有5～8個。可見鈣果4號歐李芽誘導(dǎo)采用春季萌生的幼嫩基生枝優(yōu)，于上部枝，采用4號培養(yǎng)基即改良MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L較好。

2．2 芽增殖培養(yǎng)試驗

在培養(yǎng)到第10天時各組試驗，植株生長正常，每組芽都有所增殖，其中芽增殖率最高與芽質(zhì)量最優(yōu)的分別是第2組與第4組，并且多組莖段基部切口處出現(xiàn)少量綠色沙礫狀或小米粒狀愈傷組織。在培養(yǎng)到第20天時，絕大部分植株生長正常，每組腋芽都有所增殖，其中芽增殖率最高與芽質(zhì)量最優(yōu)的分別是第3、4、5、7組，愈傷組織變化不大。在培養(yǎng)到第30天時，絕大部分植株生長良好(表4)。

由表4可以看出各因素極差及的大小順序3.07＞2.40＞2.14，對芽增殖率高低產(chǎn)生的效應(yīng)由主到次的因素順序依次是6-BA、NAA、GA₃，3者引起平均芽增殖率高低的水平依次是第3、1、2。即改良MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.02mg/L+GA₃0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L就是最佳芽增殖培養(yǎng)基配方。對其進行方差分析，得出6-BA表現(xiàn)差異顯著，NAA與GA3均不顯著。說明6-BA濃度的變化會引起芽增殖率的顯著變化，而NAA與GA3濃度的變化不會引起芽增殖率的顯著變化。對試驗結(jié)果驗證的平均芽增殖率是11.8，且芽質(zhì)量良好，明顯高于表4中平均芽增殖率的最高值9.4，說明改良MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.02mg/L+GA₃0.2mg/L+蔗糖20g/L瓊脂7g/L就是鈣果4號歐李最佳芽增殖培養(yǎng)基配方(圖版-2)。

2．3 生根培養(yǎng)試驗

含莖尖的鈣果4號歐李莖段首先在基部切口處產(chǎn)生淺黃色或白色沙礫狀愈傷組織，接著產(chǎn)生白色不定根，有的小根產(chǎn)生于培養(yǎng)基與空氣相交界的莖段基部。有的小根產(chǎn)生于培養(yǎng)基與空氣相交界的莖段產(chǎn)生的愈傷組織內(nèi)部(圖版－3，4)。說明不定根的產(chǎn)生途徑不是單一的，可以直接產(chǎn)生也可以經(jīng)脫分化再分化途徑產(chǎn)生。由表5可以看出，最適宜的生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA 1.0mg/L+KT0.02mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L。

3 討 論

外植體的帶菌狀況直接影響著培養(yǎng)體系的建立，木本植物組織培養(yǎng)中的困難之一是獲得無菌材料。錢國珍等對歐李組培技術(shù)研究以來，僅劉琳對外植體消毒進行了稍深入的研究，發(fā)現(xiàn)用0.1％升汞處理7min時污染率最低為20％，存活率最高為78％。而筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)用0.％的升汞對春季萌生的幼嫩基生枝處理6min時污染率最低為17％，存活率最高為83％。另外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，不同取材季節(jié)和部位消毒處理后的存活情況有較大差異。

同一樹上的不同部位生理年齡不同：離樹干基部的距離越遠，生理年齡越老，而靠近樹干基部的先前長出來的枝干，表現(xiàn)幼態(tài)。本試驗中利用鈣果4號歐李幼嫩的基生枝與上部枝離體培養(yǎng)進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)歐李同樣具有這一特性。

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在試管苗增殖中起決定性作用，由于植物內(nèi)源激素難以測定，因此，外源激素的加入靠一系列的試驗來修正。在芽增殖試驗中，筆者篩選出的鈣果4號歐李培養(yǎng)基配方有效芽增殖率高達11.8，遠遠高于鐘士傳等的6.9與莊麗娟等的4.99。然而，隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，部分芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，有效芽變少，適當(dāng)降低6-BA濃度與提高瓊脂濃度來進一步培養(yǎng)這些已輕度玻璃化的植株，發(fā)現(xiàn)這些植株又重新抽出正常的葉和莖來，成為正常的植株。可見隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，要適當(dāng)降低細胞分裂素和生長素比值，即降低最佳培養(yǎng)基配方中6-BA的濃度，才能保證歐李優(yōu)良組培苗不斷的培養(yǎng)出來。

4 結(jié) 論

研究表明，鈣果4號歐李組織培養(yǎng)選春季萌生的幼嫩基生枝作外植體為佳；芽增殖的最佳配方為改良MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.02mg/L+GA₃0.2mg/L蔗糖20g/L+瓊脂7g/L；最適宜的生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA 1.0mg/L+KT0.02mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L。

作者簡介：孫新政，男，副教授，主要從事園藝植物繁殖與種苗生產(chǎn)技術(shù)研究與教學(xué)。