水楊酸和紫外線對誘導(dǎo)采后葡萄果皮內(nèi)白藜蘆醇合成作用研究

摘 要：以釆收后的高妻、佳利釀、田野紅3個成熟葡萄品種為試材，采用外源噴施法研究了水楊酸(Salicylic acid，sA)對葡萄果皮白藜蘆醇(Resveratrol，Res)含量的影響；采用裂區(qū)試驗對比研究不同品種、不同紫外線種類、同一紫外線不同輻射劑量對葡萄果皮Res含量的影響。結(jié)果表明，100mg/L的SA噴施處理可以顯著提高3個葡萄品種果皮中的Res含量，誘導(dǎo)田野紅的Res合成的效果顯著高于高妻和佳利釀。除UV-B處理對高妻果皮中Res含量無顯著影響外，其他UV-B和UV-C處理均能導(dǎo)致采后3個品種的葡萄果皮中Res含量的顯著增加，且UV-C對Res誘導(dǎo)積累效果極顯著地優(yōu)于UV-B。輻射劑量在0～3.6kJ/m²范圍內(nèi)，3個葡萄品種果皮Res含量有隨UV-B和UV-C輻射劑量的增加而增大趨勢，但不同紫外線種類和輻射劑量對Res誘導(dǎo)積累效果因品種不同存在差異。

關(guān)鍵詞；葡萄；水楊酸；紫外線－B；紫外線－C；白藜蘆醇

中圖分類號：S663.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－30－04

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)，化學(xué)名為芪三酚(3，4′，5-trihYdroxystilbene)屬多酚化合物。1976年在葡萄屬植物中找到了該物質(zhì)，并認為是一種葡萄屬植物對真菌侵染、機械傷害、紫外線照射后的反應(yīng)產(chǎn)物一植物抗毒素(phytoalexin)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Res具有很強的預(yù)防和抑制心血管疾病及抗癌作用。由于葡萄中Res含量高，且葡萄種質(zhì)資源豐富以及來源于葡萄的Res具有純天然的特點，符合了當(dāng)今人們對醫(yī)藥保健產(chǎn)品的要求，因此，近年來其研究與應(yīng)用已經(jīng)引起科學(xué)界和企業(yè)界的極大重視。

葡萄植物受到非生物脅迫時，Res等次生代謝物質(zhì)合成通常急劇增加凹。紫外線照射也是一種非生物因子脅迫。根據(jù)波長，紫外光可主要分為UV-A(315～390nm)、UV-B(280～315nm)和Uv－C(小于280nm)3部分。人工UV-C照射葡萄可導(dǎo)致葡萄Res含量大量增加。有關(guān)UV-B輻射對Res的誘導(dǎo)的影響目前仍不清楚。另外，葡萄植物體內(nèi)的Res等次生代謝物質(zhì)合成受到信號分子的調(diào)節(jié)，水楊酸(Salicylic acid，SA)是植物體內(nèi)普遍存在的一種小分子酚類化合物，也是植物體內(nèi)的一種響應(yīng)逆境反應(yīng)的重要信號分子。但是SA對誘導(dǎo)葡萄果皮內(nèi)Res合成的作用鮮見研究報道。

我們報道了SA對誘導(dǎo)采后葡萄果皮內(nèi)Res合成作用以及UV-B和UV-C對誘導(dǎo)葡萄果皮內(nèi)Res合成效果的對比研究結(jié)果，以期為人工無公害調(diào)控葡萄果實Res合成提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料

本研究于2004年采用高妻(Takatsuma)、佳利釀(Carignane)、田野紅(Tano Red)3個葡萄品種的成熟果實，均采自中國科學(xué)院植物研究所葡萄種質(zhì)資源圃。植株定植于1993年春。采用籬架式扇形整枝。株距1.5m，行距2.5m，南北行向。生長結(jié)果良好。管理水平中等。

1．2 方法

高妻、佳利釀、田野紅3個葡萄品種的取樣時間分別為2004年的8月30日、9月25日和9月10日。果實采收后，選用成熟度、著色、顆粒大小較為一致的無損傷和無病蟲為害的果粒，立即噴施SA或進行UV輻射處理。每處理的1次重復(fù)高妻采用15粒果實；佳利釀和田野紅分別采用30粒果實。

1．2．1 SA誘導(dǎo) 用重蒸水配成濃度為100mg/L的SA溶液，混勻噴施果粒表面，并以表面噴施重蒸水的果粒為對照，3次重復(fù)。于暗處靜置待果粒干燥后，在控制溫度為(20±2)℃的生長室中，黑暗避光條件下放置24h，分離葡萄果皮，液氮速凍后磨碎，-40℃保存待測。

1．2．2 UV處理 在裝有3支UV-B或UV-C燈管(北京電光源研究所)的培養(yǎng)架下，通過調(diào)節(jié)樣品放置高度獲得輻照光強為200μW/cm²的UV-B和400μW/cm²UV-C(采用北京師范大學(xué)光電儀器廠生產(chǎn)的紫外輻照計測定輻射強度)對樣品進行輻射處理。通過采用不同的照射時間設(shè)置UV-B和UV-C各3個不同的輻射劑量：1.2kJ/m²(UV-B10min，UV-C5min)、2.4 kJ/m²(UV-B 20min，UV-C 10min)和3.6kJ/m²(UV-B 30min，UV-C 15min)，照射過程中每隔2.5 min將果粒翻轉(zhuǎn)1次，使果粒均勻接受UV-B或UV-C照射，同時以不進行UV-B和UV-C照射的果粒為對照。采用裂區(qū)設(shè)計，品種(A因素)為主因素。置于主區(qū)。輻射劑量(B因素)置于副區(qū)。主、副區(qū)均采用隨機區(qū)組設(shè)計，主區(qū)重復(fù)3次。照射后葡萄果粒和對照果粒在控制溫度為(20±2)℃的生長室中，-黑暗避光條件下放置24h。分離葡萄果皮，液氮速凍后磨碎-40℃保存待測。

1．2．3 葡萄Res提取和測定 Res提取和測定參照李曉東等的方法：準(zhǔn)確稱取3g葡萄皮凍樣，置于研缽中，加入少量石英砂和乙酸乙酯并研磨成勻漿，共用15mL乙酸乙酯分次洗至刻度試管，室溫避光浸提24h后，10000g離心15min，取上清液，45℃減壓濃縮至于，用1mL甲醇溶解定容，過0.45μm微孔濾膜供HPLC分析。采用Dionex Summi^TMHPLC系統(tǒng)，包括Dionex P680泵，Dionex TCC-100柱溫箱，Dionex PDA-100檢測器(美國戴安公司)。色譜柱：]nertsil ODS-3柱(250mmL×4.6mmL.D.，5μm粒徑，日本GL科技公司)，Sunchrom C18保護柱(北京金歐亞科技發(fā)展有限公司)。柱溫：25℃，進樣量：10μL，流動相：40％乙腈(gradient grade，德國Sigma-Aldrich公司)。流速：0.6mL/min，檢測波長：306nm。

2 結(jié)果與分析

2．1 SA處理對采后葡萄果皮Res的誘導(dǎo)作用

100mR/L的SA噴施處理可以顯著提高3個品種葡萄果皮中的Res含量，但是SA噴施處理不同品種誘導(dǎo)葡萄果皮Res合成能力存在差異(圖1)。盡管成熟時田野紅果皮中Res含量最低，但SA噴施后24h，誘導(dǎo)Res合成的效果最好，為對照的13.6倍，達8.21ug/g，并且果皮中Res的絕對含量也顯著高于其他2個品種經(jīng)100mg/L的SA噴施處理的。高妻和佳利釀2品種對照果皮中Res含量較田野紅高，SA處理后24h也顯著增加了Res含量，但效果較田野紅差，僅分別為對照的1.62倍和2.77倍。

2．2 UV-B和UV-C處理對采后葡萄果皮Res的誘導(dǎo)作用

UV-B和UV-C處理均能導(dǎo)致采后3個品種的葡萄果皮中Res含量的增加，但效果因品種、紫外線的種類和輻射劑量而存在差異。組間效應(yīng)檢驗(tests of between-subjects effects)表明(表1)，不同品種(因素A)、不同輻射劑量的UV-B或UV-C處理(因素B)之間果皮中Res含量有極顯著差異；同一品種同一輻射劑量的UV-B或UV-C處理的3次重復(fù)[C(A)]間無顯著差異；品種和UV-B或UV-C輻射劑量間的交互作用(因素A*B)對葡萄果皮中Res含量也存在極顯著的影響。

UV-B和UV-C輻射對采后葡萄果皮中Res誘導(dǎo)與積累與葡萄品種關(guān)系密切(表2)。采用UV-B進行輻射處理，24 h后，田野紅果皮中Res含量極顯著高于佳利釀和高妻，但采用UV-C進行輻射處理，高妻果皮中Res含量最高，極顯著高于佳利釀和田野紅，且對佳利釀Res誘導(dǎo)效果顯著高于田野紅。此外，對于供試的3個品種，UV-C對Res誘導(dǎo)積累效果均極顯著地優(yōu)于UV-B，UV-C輻射處理3個品種果皮中Res含量較UV-B分別高8.66倍、4.41倍、1.31倍。

3個供試品種果皮Res含量對UV-B和UV-C的不同輻射劑量的反應(yīng)見表3。從表3可以看出，對于高妻，UV-B在所選輻射劑量范圍內(nèi)果皮中Res的含量與對照間不存在顯著差異：UV-C在輻射劑量為2.4kJ/m²和3.6kJ/m²時Res含量均顯著增加，分別為39.34μg/g和32.34μg/g，為對照的13.20和10.85倍。對于佳利釀，UV-B在輻射劑量為3.6kJ/m²時Res含量最高，為4.56μg/g，為對照的3.06倍，極顯著高于對照，但1.2kJ/m²和2.4kJ/m² 2個處理果皮中Res含量與對照不存在顯著差異；UV-C在輻射劑量1.2～3.6kg/m²，隨輻射劑量的增加Res含量增大，不同劑量處理間存在極顯著差異，并且所有3個UV-C處理果皮中Res含量均極顯著高于對照。對于田野紅，輻射劑量在1.2～3.6kJ/m²，果皮Res含量隨UV-B和UV-C輻射劑量的增加而均增大，并極顯著高于對照，輻射劑量為3.6kJ/m²時UV-B和UV-C處理果皮中Res含量分別為對照的16.58倍和26.45倍，達9.95μg/g和15.87μg/g。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，UV-B和UV-C處理均能夠提高葡萄果皮Res合成能力(表3)，但是，UV-C誘導(dǎo)采后葡萄果皮中的Res合成的效果遠遠大于UV-B(表2)，表明紫外線波長在Res誘導(dǎo)過程中十分重要。白藜蘆醇生物合成需一系列相關(guān)酶：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、4－香豆酸CoA連接酶(4CL)、二苯乙烯合成酶(ST5)的協(xié)同作用，經(jīng)苯丙氨酸聚丙二酸鹽途徑。轉(zhuǎn)化為Res，并且二苯乙烯合成酶(STS)是Res合成的關(guān)鍵酶。Fritzemeier等研究發(fā)現(xiàn)，UV-C處理葡萄葉片后15h，STS活性提高100倍。并且與白藜蘆醇合成相關(guān)的另外兩種酶(PAL、CA4H)同時被誘導(dǎo)。表明UV-C通過某種途徑提高了Res合成途徑中相關(guān)酶活性，從而產(chǎn)生了更多的Res。有研究表明，STS對光的感受區(qū)在260～270nm，即UV-C光譜區(qū)域，這應(yīng)該是UV-B處理誘導(dǎo)葡萄果皮中Res效果遠小于UV-C的主要原因。但無論如何，UV-B和UV-C誘導(dǎo)葡萄Res合成與積累的機制是否有差異，仍需深入研究。此外，臭氧層對紫外線吸收因波長不同而有差別，對波長為360、320和280 nm光波吸收系數(shù)分別為1×10^-3、1和10²。UV-A可以全部通過臭氧層，UV-B只部分被臭氧層吸收，有相當(dāng)部分能到達地表，波長短、能量高的UV-C，幾乎全部被臭氧層吸收。這就意味著，自然條件下，UV-C對葡萄果實內(nèi)Res合成并沒有起到作用。因此需要通過人工UV-C輻射方法，誘導(dǎo)采后葡萄果皮內(nèi)合成和積累Res，從而獲得富含Res的鮮食葡萄和葡萄加工原料。

外源施用SA能夠影響植物體內(nèi)誘導(dǎo)抗病性等多種生理過程。本研究結(jié)果表明外源SA，與機械損傷、真菌侵染和紫外線一樣，能夠誘導(dǎo)葡萄果皮產(chǎn)生Res(圖1)。雖然有報道外源SA能夠顯著提高黃瓜葉片PAL活性，但目前資料還不足以確定外源施用SA誘導(dǎo)Res在葡萄果皮內(nèi)合成與積累的調(diào)控機制。SA是植物一種響應(yīng)逆境反應(yīng)的重要的信號分子。還有研究表明植物受到UV脅迫時內(nèi)源SA水平增高。那么UV誘導(dǎo)葡萄果皮Res生物合成過程中是否存在SA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是未來的一個重要研究課題。

4 結(jié) 論

100mg/L的SA噴施處理可以顯著提高采后高妻、佳利釀和田野紅葡萄果皮中的Res含量，但是對不同品種誘導(dǎo)葡萄果皮Res合成能力存在顯著差異。對于供試的3個葡萄品種，UV-C對Res誘導(dǎo)積累效果均極顯著地優(yōu)于UV-B(分別高8.66倍、4.41倍、1.31倍)。除UV-B處理對高妻果皮中Res含量無顯著影響外，輻射劑量在0～3.6kJ/m²范圍內(nèi)，3個葡萄品種果皮Res含量有隨UV-B和UV-C輻射劑量的增加而增大趨勢，但不同紫外線種類和輻射劑量對Res誘導(dǎo)積累效果因品種不同存在差異。

作者簡介：李曉東，在讀博士生。