優質大果楊梅新品系烏紫楊梅的生物學特性及其ＲＡＰＤ鑒定

摘 要：烏紫楊梅是從浙江省象山縣的自然實生資源中選出的一個優質、大果、早熟楊梅新品系。烏紫楊梅果實正圓形，果面紫黑色，單果重為23.49g；總糖、可溶性固形物和花色苷含量分別為83.6mg/g、13.26％、0.50mg/g，顯著高于東魁楊梅；總酸為0.92％，比東魁略低；成熟期為6月15～24日，比東魁楊梅早7～10d。RAPD分析顯示，烏紫楊梅新品系母本樹與烏紫楊梅嫁接后代(嫁接第1代、第2代、第3代、第4代)的相似性極高，為0.94－0.98；他們之間的遺傳距離也最小。而烏紫楊梅及嫁接后代與東魁、炭梅、水梅的之間相似性較低、遺傳距離也相距較遠。上述結果表明烏紫楊梅是一個不同于其他楊梅品種、后代表現穩定的大果、優質楊梅新品系。

關鍵詞：烏紫楊梅；新品種；優質；大果；RAPD鑒定；遺傳穩定性

中圖分類號：S667.6 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－64－04

楊梅為我國特有的水果與經濟林木，經濟栽培主要分布在浙江等南方省區。2004年浙江省楊梅種植面積已達600km²，產量超過27萬t，2者均位居全國第一。浙江楊梅資源豐富，擁有東魁、荸薺種、丁岙、晚稻4大楊梅良種，特別是大果型、品質優、適應性強的東魁已成為全國發展最為迅猛的楊梅品種。但東魁楊梅為晚熟品種；目前，生產上缺少與之搭配的大果型早熟品種。近年來，我們在浙江省象山縣發現了一個優質、大果的楊梅實生單株，以及農民自發從該優質單株上采穗嫁接后形成的后代群體。該新品系在浙江象山于6月中下旬成熟，比當地東魁楊梅提早7～10d。目前將該新品系暫定名為烏紫楊梅。該新品系是繼東魁后又一個大果型的楊梅新品種，可拉長大果楊梅的供應期，有極高的推廣應用價值。為加快烏紫楊梅的品種鑒定和推廣，有必要對烏紫楊梅的生物學特性和嫁接后代的遺傳穩定性進行觀察與鑒定。近年來，RAPD(randomly amplifiedpolymorphic DNA)分析因其快速、簡單、經濟，廣泛應用于楊梅、枇杷、李田、梨、櫻桃、獼猴桃、杏等果樹分類和品種鑒定，尤其是對來源于自然雜交的品種鑒別。為此，本研究以烏紫楊梅為材料，對該新品系的生長結果習性進行了觀察，并采用RAPD分子標記技術對烏紫楊梅母本樹及其嫁接后代與本地水梅、本地炭梅和東魁楊梅進行比較鑒別，以期明確該新品系的生物學特征、遺傳穩定性，為烏紫楊梅新品系的栽培技術開發和新品種鑒定提供科學依據。

1 材料和方法

1．1 材料

本試驗材料楊梅采自浙江省象山縣曉塘鄉焦頭村。RAPD分析所用幼葉采自烏紫楊梅新品系母本-樹、母本樹附近的雄株(雄株1、雄株2)、烏紫楊梅嫁接樹(嫁接第1代、第2代、第3代、第4代)、本地炭梅、本地水梅和東魁等楊梅春梢未完全展開的幼葉，采集后經液氮冷凍，保存于70℃供DNA提取用。

1．2 生物學與植物學特性觀察

選14年生烏紫楊梅高接后代，主要觀察葉、花、果、梢的物候期和生長發育特性。

1．3 楊梅果實品質分析

葡萄糖、果糖、蔗糖含量測定采用HPLC法，可溶性固形物含量(SSC)測定用手持折光儀法，可滴定酸含量用酸堿滴定法，花色苷測定用pH差示法。重復3次。

1．4 基因組DNA提取

楊梅幼葉基因組DNA提取參考Congiu等的方法略作改進：取1g葉片，加液氮研磨后轉入50mL離心管中，加入10mL預熱至65℃的C了AB提取液(含100mmol/L Tris-HCl，15mmol/L EDTA，1.2moL/LNaCl，2％CTAB，0.5％β－巰基乙醇，pH8.0)。將盛有樣品的提取液在65℃水浴中保溫45～60min。加入等體積氯仿一異戊醇(24:1)，搖勻，靜置5min，4℃下8000G離心10min，上清液中加入等體積預冷異丙醇，緩緩搖勻，可見白色或黃白色DNA絮狀沉淀，鉤出絮狀沉淀，在75％K，醇中洗滌沉淀2～3次，37℃或室溫下風干，加入適量(1mL左右)TE緩沖液(10mmol/L Tris-HC1.1 mmol/L EDTA，pH8.0)，溶解DNA，加入10mL RNase(10μg/L)，37℃下保溫1h，分別用等體積苯酚－氯仿、氯仿－異戊醇抽提純化DNA，上清液加入1/10體積NaAc，2倍體積無水乙醇，-20℃放置30min，4℃下10000g離心10min。最后將DNA溶于適量(200～300μL)TE緩沖液中，貯于-20℃。

1．5 RAPD反應體系

PCR反應在了hermoHybaid PX2 PCR儀上進行，PCR反應體系為：35μL ddH₂O，5μL 10×PCR反應緩沖液(500mmol/L KCL。100mmol/L Tris-HCl，1.0％Triton X-100)，4μL 25mmol/L MgCL₂，4μL dNTPs，2μL 0.5μmol/L隨機引物(RAPD引物選用OPERON的RAPD^R10mer Kits中的68個隨機引物進行了PCR擴增)，0.5μL模板DNA(約25ng)，混勻后離心5s；將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，加入0.5U Taq DNA聚合酶，混勻后加入1滴礦物油覆蓋于反應混合物上。PCR擴增條件為：94℃預變性5min，94℃變性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，40個循環，最后72℃延伸10min。取8μLPCR產物在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳，用BIO-RADXR凝膠成像系統對電泳條帶進行觀察和拍照。

1．6 RAPD譜帶統計和聚類分析

電泳圖譜中同一位點RAPD譜帶存在時賦值為1，不存在時賦值為O。利用NTSYSpc2.0聚類分析軟件計算品種間相似性和遺傳距離。

2 結果與分析

2．1 生物學特性

2004—2006年觀察表明，烏紫楊梅花芽2月下旬萌動，3月10日初花，3月22日-4月2日盛花，4月2-13日末花。葉芽萌動期3月22日，春梢發生期3月26日-5月19日，平均梢長6.5cm。夏梢6月24日-7月中旬；秋梢8月下旬-9月底。春梢和夏梢為主要結果母枝，結果母枝平均長度約為10cm。果實初果期為4月8日左右，4月28-30日定果，5月4-16日硬核，6月5日果實陰面轉白、少量著色見紅，6月9日果實紫紅色、味酸，6月16-18日果實紫黑色、第1批果實成熟。

烏紫楊梅葉長×葉寬為11.2cm×3.5cm，葉緣全緣，葉色深綠，葉尖為圓鈍，葉基呈鍥形。花序長為0.53～1.55cm，粗為0.20～0.28cm，每花序有7朵以上花可開放。果實呈正圓形(圓球形)，果頂平，果面縫合線不明顯。肉柱特征為長、粗、鈍、硬。種子呈橢圓形，縫合線突起，核面粗糙。

2．1 果實主要品質特征

比較在象山同一地點栽培的烏紫楊梅、本地炭梅和東魁的品質顯示，烏紫楊梅的葡萄糖、蔗糖和可溶性固形物含量顯著高于本地炭梅和東魁，而可滴定酸含量比本地炭梅和東魁低。花色苷含量也顯著高于東魁，單果質量比東魁略低，但差異不顯著(表1)。上述結果表明，烏紫楊梅是一個優質、大果的楊梅新品系。

2．2 引物篩選和RAPD分析

為分析烏紫楊梅的遺傳穩定性和與其他品種間的遺傳差異，我們選用了RAPD^R10mer Kits(OPERON)的68個隨機引物對烏紫楊梅母本樹及后代和其他楊梅品種等10個楊梅材料的DNA進行PCR擴增，篩選出了47個擴增結果較好且具有多態性的引物。所用的47個引物共計擴增出370個位點，其中多態性位點為250個，占總位點數的67.6％。擴增出的DNA片段長度多數在100～2500bp，個別引物能擴增出3000bp左右的片段。每個引物擴增出的DNA條帶數為11～32條，平均每個引物能擴增出20條帶。其中引物$35擴增出的多態性位點最多，圖1是引物$35擴增的烏紫楊梅母本樹及后代和其他楊梅品種等10個楊梅材料的DNA圖譜，該圖譜可明顯將烏紫楊梅與其他品種區分開來。

2．3 遺傳距離與相似性分析

對這47個引物擴增出的譜帶進行DICE相似性分析，采用UPGMA進行聚類分析，結果如圖2所示，烏紫楊梅母株及1～4代同屬于一族，其中烏紫楊梅第1代(烏紫1st)與母株之間的相似性最高，相似系數達0.98，烏紫楊梅第3代(烏紫3rd)與母株相似性最低，相似系數為0.93，烏紫楊梅第2代(烏紫2nd)和第4代(烏紫4th)與母株的相似系數分別為0.96和0.94。遺傳距離也是烏紫楊梅1～4代與母株之間最近。而烏紫楊梅1～4代及母株與東魁、炭梅、雄株和水梅之間的相似性較低，遺傳距離也較遠。

3 討 論

楊梅是我國特有水果，但除東魁外，大果楊梅新品種罕有報道。本研究顯示，烏紫楊梅單果質量為23.49g、SSC 13.26％、總糖83.6mg/g、總酸0.92％、花色苷0.50mg/g。除單果質量比東魁略低外，其他品質指標均優于東魁，表呀烏紫楊梅是一個品質優于東魁楊梅新品系。 由于烏紫楊梅的成熟期比東魁提早7-10 d，而單果質量與東魁接近，因此，烏紫楊梅可拉長大果楊梅的供應期，推廣發展潛力巨大。

RAPD技術是利用PCR方法對所研究材料的基因組DNA進行擴增，以電泳譜帶形式檢測材料之間的多態性，能夠從DNA分子水平揭示品種間的遺傳差異。RAPD方法通常用于實生變異的品種區分和鑒別，并已在楊梅屬植物分類中得到應用。本研究用RAPD分析顯示，烏紫楊梅母本樹及其嫁接后代之間的DNA水平的基本沒有差異，表明后代遺傳穩定。用RAPD能明顯地將烏紫楊梅與東魁等品種區分開來，表明在DNA水平上烏紫楊梅母本樹及其嫁接后代與當地水梅、炭梅及東魁之間存在較大差異，證明烏紫楊梅是一個遺傳上不同其他楊梅品種的實生變異。本研究結果也表明，從本試驗材料中用RAPD分析不能確定烏紫楊梅品種的起源。因此，要揭示烏紫楊梅的起源需要從當地收集更多的楊梅材料和應用多態性條帶更多的AFLP等分子標記技術。

4 結 論

烏紫楊梅果大，可溶性固形物含量高，成熟期為6月15-24日。RAPD分析表明，烏紫楊梅新品系母本樹與烏紫楊梅嫁接后代之間的相似性極高，遺傳距離也十分接近。而烏紫楊梅母本及嫁接后代與東魁、炭梅、水梅之間的相似性較低、遺傳距離也較遠。因此，烏紫楊梅是一個遺傳穩定的優質、大果、早熟楊梅新品系。

作者簡介：錢皆兵，男，高級農藝師，從事果樹栽培研究。