甜瓜蔓枯病菌子實體法分離及Ａ型菌株產孢條件研究

摘 要：為解決甜瓜蔓枯病菌(Didymalla bryoniae)組織分離法中枯萎病菌污染和單孢分離法操作復雜的問題，采用挑取單個子實體分離純化獲得甜瓜蔓枯病菌A型菌株。該菌株在12h熒光/12h黑暗的常規光照條件下，不能形成分生孢子器。但經過一定時間的暗處理和間歇紫外燈(12h紫外燈/12h黑暗)照射后則能夠產生大量分生孢子。研究了光照、溫度、pH值、培養基、碳源、氮源對產孢量的影響。綜合各種因素，A型菌株產生分生孢子的最佳條件為：7d暗培養和4d間歇紫外燈處理的光照條件下，只含有磷酸二氫氨的馬鈴薯平板培養基，25℃時產生的分生孢子量最多。

關鍵詞：甜瓜；蔓枯病菌；分離；產孢

中圖分類號：S652 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－84－05

瓜類蔓枯病菌Mycospharella melonis(國際上現多報道為Didymella bryoniae)危害多種葫蘆科作物，如甜瓜、西瓜、南瓜、黃瓜、哈密瓜等。在新疆、甘肅、上海、浙江等省市區的哈密瓜和西甜瓜產區，蔓枯病大田發病率普遍在20％～30％。在連作地和溫室中高達80％。造成的損失甚大。

在發病嚴重的地塊中，蔓枯病菌常與枯萎病菌(Fusarium oxysporum)伴生。使用莖部組織法分離時，常會得到兩菌雜生的菌落，而且通常是枯萎病菌占優勢；陳熙等曾采用單孢分離法分離純化蔓枯病菌，但操作復雜，耗時長。

不同類型菌株產生子實體和孢子的能力差異很大，Chiu等根據培養性狀將蔓枯病菌分為A、As、B－a、B－1a、B－b5個類型，其中只有A型菌株不能在常規條件下產生孢子器和孢子，其他4種類型的菌株均可在不同的生長階段產生孢子。

我們從南京和新疆的感病甜瓜上分離的蔓枯病菌株，在PDA上培養時，菌落背面初白色，后期變為黑色，基生菌絲深褐色，有同心輪紋；氣生菌絲發達。絮狀、中間稠密，略隆起，初白色，老化后灰白色，不形成子囊座和分生孢子器，這與Chiu等和賈菊生間描述的A型菌株極其相似。

為了解決甜瓜蔓枯病菌分離過程中的枯萎病菌混雜和大規模接種鑒定所需的孢子問題，我們以感染蔓枯病菌的甜瓜莖蔓為試材，對甜瓜蔓枯病菌的分離方法和A型菌株的產孢條件進行了系統研究，首次使用子實體法分離得到了甜瓜蔓枯病菌純化菌落，快速誘導產生了大量分生孢子，在甜瓜、黃瓜上回接時致病性強，為蔓枯病接種鑒定、抗病育種以及綜合防治奠定了基礎。

1 材料和方法

1．1 材料

2005年春從江蘇農業科學院試驗地、南京玄武區麒麟鎮試驗地和新疆農業科學院試驗地發病嚴重的地塊中采集癥狀典型的甜瓜蔓枯病蔓。

1．2 分離方法

1．2．1 子實體法 選用子實體突出表皮的1～2cm蔓枯病蔓，自來水沖洗2～3min，75％酒精表面消毒30s，無菌水清洗2～3min，然后用滅菌的解剖針挑取單個子實體，置于盛有無菌水的滅菌培養皿中浸泡2min。

1．2．2 組織分離法 選取甜瓜蔓枯病病蔓的病健交界處，75％酒精表面消毒30s，切取4～5mm²的小塊，5％次氯酸鈉表面消毒1、3、5、7min，無菌水沖洗2～3次。

將子實體或組織塊接種于馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)上，培養基添加濃度均為5mg/mL的利福平和氨芐青霉素各1mL/L，每個培養皿接種5個點，每批病樣接種10皿。以上操作均在超凈臺上進行。接種后的培養基在25℃，12h熒光/12h黑暗的條件下培養。4～5d后觀察有無污染。

1．3 不同因子對病菌產孢量的影響

1．3．1 光照條件對病菌產孢量的影響 用解剖針挑取菌絲接種于PDA培養基平板的中央，暗培養0、1、3、5、7、9d后，分別在40W紫外燈(12h紫外燈/12h黑暗)下30cm照射0、2、4、6、8 d，共計30個處理，另設12h光照/12h黑暗、24 h光照，處理2～3周為對照。25℃下培養，將整個菌落用50mL無菌水配成懸浮液后用血球計數板測產孢量。實驗中所使用的培養皿直徑為15cm，每處理設3次重復，下同。

1．3．2 溫度對病菌產孢量的影響 所用培養基為PDA，接種后分別于0、5、10、15、20、25、30、35、40℃共9個溫度處理于7d黑暗+4d紫外燈(12h紫外燈/12 h黑暗)照射的條件下培養。

1．3．3 不同pH值對病菌產孢量的影響 所用培養基為PDA，用已滅菌的0.5mol/L的HCl溶液和0.5mol/L的NaOH溶液調節滅菌后的馬鈴薯葡萄糖培養基的pH值，METTLER TOLEDO 320-S型pH計標定為3、4、5、6、7、8、9、10、11共9種不同的酸堿度，配制成不同pH值的固體培養基。光照條件同1．3．2。

1．3．4 培養基種類對病菌產孢量的影響 理查培養基(KNO，10.00g、KH₂O₄5.00g、MgSO₄·7H₂O2.50g、FeCl₃0.02g、蔗糖50.00g)，查彼培養基(NaNO₃2.00g、K₂HPO₄1.00g、KCl0.50g、MgSO₄·7H₂O0.50g、FeSO₄0.01g、蔗糖30.00g)，半組合培養基(天門冬酰胺2.00g、K₃PO₄1.25g、MgSO₄·7H₂O0.75g)，麥芽糖蛋白胨培養基(麥芽糖3.00g、蛋白胨1.00g)，酵母浸膏培養基(可溶性淀粉5.00g酵母浸膏4.00g、K₂HPO₄1.00g、MgSO₂·7H₂O0.50g)，甜瓜果泥培養基(250mL甜瓜果泥)，玉米粉培養基(玉米粉30.00g)，燕麥培養基(燕麥片30.00g)，馬鈴薯葡萄糖培養基(馬鈴薯200g、葡萄糖20.00 g)，水培養基共10種培養基，所有培養基均添加瓊脂20.00g、蒸餾水1000mL，光照條件同1．3．2。

1．3．5 不同碳源對病菌產孢量的影響 所用培養基為馬鈴薯培養基(馬鈴薯200g、瓊脂20.00g、1000mL蒸餾水)，培養基分別添加蔗糖、麥芽糖、木糖、果糖、乳糖、馬鈴薯淀粉、甘露醇、可溶性淀粉、糊精、山梨醇、葡萄糖各20.00g/L，配制成11種不同碳源的固體培養基。光照條件同1．3．2。

1．3．6 不同氮源對病菌產孢量的影響 所用培養基為馬鈴薯培養基，分別添加D、L－天門冬酰胺、L－半胱氨酸、氨基乙酸、甘氨酸、蛋白胨、酵母提取物、NH₄H₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、尿素各2.00g/L，配制成10種不同氮源的固體培養基。光照條件同 1．3．2。

2 結果與分析

2．1 分離效果

使用子實體法分離蔓枯病菌時，2d后可看到菌絲，挑取僅可見的菌絲2～3次轉接后得到純培養，枯萎病菌(E.oxysporum)雜生的菌落很少，只有5％；但細菌的污染率達到10％。組織分離法中，組織消毒3min時，培養3d左右經常出現蔓枯病菌和枯萎病菌雜生的菌落，比率高達54％，而且枯萎病菌占優勢，轉接5～6次后，仍不能得到蔓枯病菌的純培養；但細菌污染率僅為6％。當次氯酸鈉消毒時間超過5min時，蔓枯病菌被殺死，只能得到枯萎病菌(表1)。

2．2 產孢條件

2．2．1 不同光照條件下的產孢量 有以下3種處理的結果。1)暗培養和紫外燈處理互作下的產孢量：在12h熒光/12h黑暗和24h熒光條件下培養2～3周，該菌株不能產生孢子器和孢子。暗培養和紫外燈處理的兩因素的互作中，產孢量差異顯著。7d暗培養后進行4d紫外燈光處理(12h紫外燈/12h黑暗)時產生分生孢子的數量最多，達到7，184x106個/mL。7d暗培養和6d紫外燈照射，5d暗培養和8d紫外燈照射后的產孢量與前者無明顯差異。在蔓枯病菌的產孢過程中，暗處理0、3d后紫外燈照射0～8d都不能產孢；暗處理0～9d后不使用紫外燈照射亦不能產孢(表2)。

2)不同暗處理時間下的產孢量：暗處理時間不同時，產孢量差異顯著。7d時產生分生孢子的數量最多，達到4.189×10⁶個/mL。當暗培養時間為9d時，產孢量反而降低，可能是因為菌絲營養生長時間過長發生老化，對紫外燈的誘導反應不敏感。不經過暗培養和暗培養1d均不能產孢(表3)。

3)不同紫外燈處理時間下的產孢量：在不同的紫外燈處理時間下，產孢量差異顯著。隨著紫外燈照射時間的延長，產生分生孢子的數量逐漸增加。紫外燈處理8d時，產孢量達到3.695×10⁶個/mL；處理4d和6d時，產孢量無明顯差異；不經過紫外燈照射則不能產孢(表4)。

2．2．2 不同溫度對病菌產孢量的影響 病菌在15℃～30℃均能產孢，25℃最適合產孢，產孢量達到7.720×10⁶個/mL。20℃時的產孢量僅次于25℃，但在0.05和0.01的水平上差異均顯著：15℃和30℃時只能產生極少量的分生孢子；低于15℃和高于30℃時不能產生孢子(表5)。

2．2．3 不同pH值對病菌產孢量的影響 病菌在pH值5～9之間均產孢，但以pH值為6時產孢最多，為7.053×10⁶個/mL，病菌在偏酸性的條件下利于產孢。pH值小于4和大于10時不產孢(表6)。

2．2．4 不同培養基對產孢量的影響 蔓枯病菌在不同培養基上產生孢子的類型和數量差異較大。PDA上產生分生孢子且產孢量最高，達7.634×10⁶個/mL。其次為甜瓜汁培養基，產生子囊孢子，產孢量為3.356×10⁶個/mL；燕麥培養基產生的子囊孢子較少，僅為0.264×10⁶個/mL。玉米培養基、麥芽糖蛋白胨培養基、酵母浸膏培養基只能形成少量子實體，不能產生孢子。理查培養基、半組合培養基、查彼培養基、水培養基則只有菌絲，不能形成子實體(表7)。

2．2．5 不同碳源對病菌產孢量的影響 供試的11種碳源中，乳糖產生分生孢子的效果最好，達到9.025×10⁶個/mL，葡萄糖次之。麥芽糖產孢量最少，僅為1.926×10⁶個/mL。果糖不能產生孢子(表8)。

2．2．6 不同氮源對病菌產孢量的影響 供試的10種氮源中，在馬鈴薯培養基中添加磷酸二氫氨時，產生分生孢子的數量最高，多達13.897×10⁶個/mL。酵母提取物次之，L－半胱氨酸、硝酸鈉、DL-天門冬酰胺產孢均較少。蛋白胨、氨基乙酸、甘氨酸、硫酸銨、尿素能夠產生少量的子實體，但均不能產生孢子(表9)。

3 討 論

子實體分離法與組織分離法相比，得到純化蔓枯病菌落幾率大。為減少細菌的污染，PDA培養基中應添加抗生素。實驗中選擇子實體突出的病蔓，便于挑取單個子實體。與單孢子分離法相比，子實體法不僅解決了兩菌的混雜問題，而且簡單易行。肉眼下就可進行操作，且操作所需時間短。

來源不同的蔓枯病菌菌株在相同的培養基上產生子實體的數量有很大差異。戴富明等發現，在12h熒光/12h黑暗的條件下，只有美國菌株和一個來自上海松江五厙鎮的蔓枯病菌株(共3個)能夠形成大量黃褐色的小點即分生孢子器；美國學者進行接種體制備時通常在12h熒光/12h黑暗條件下培養10～14d后獲得大量分生孢子。對于不能產孢的蔓枯病菌菌株，王曉東等在黃瓜、打瓜和葫蘆等果實上誘導得到了蔓枯病菌的無性子實體。但在各種瓜類培養基上誘導時均未獲得滿意的效果；Vander Meer等，使用麥芽浸膏培養基在20℃下近紫外燈處理12h/d得到分生孢子；VanSteekclenburg等利用櫻桃煎汁培養基黑光燈下處理，14d后得到分生孢子。

我們從新疆和南京地區分離到的A型菌株在12h熒光/12h黑暗條件下亦不能產生分生孢子，曾嘗試各種方法誘導產孢，如使用不同的適宜產孢的培養基、改變碳氮源、降低碳源比例，劃破菌落等，均未得到孢子器和孢子。本試驗通過暗培養和間歇紫外燈處理(12h黑暗/12h紫外燈)相結合的方法，在常規的馬鈴薯葡萄糖培養基上較短時間內得到了大量分生孢子，并系統研究了各種因素對產孢量的影響，初步明確了最適于產孢的暗處理和紫外燈照射時間、溫度、pH值、碳源、氮源，但碳源、氮源的互作效應有待進一步探討。

作者簡介：李英，在讀碩士生，主要從事黃瓜抗病育種與生物技術研究。