番木瓜雄性性別的ＲＡＰＤ和ＳＣＡＲ標記

摘 要：利用RAPD標記技術鑒定番木瓜雄性性狀。在214條隨機引物中，用引物Z18擴增得到1條雄性多態性片段，此片段存在于試驗所用材料的所有雄株中而兩性株和雌株沒有，將其命名為Z18-1000。根據對該片段的序列分析結果重新設計了2對引物將RAPD標記成功轉化成了SCAR標記，并命名為SD－1000。

關鍵詞：番木瓜；雄性性狀；RAPD；SCAR

中圖分類號：S667.97 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－72－04

番木瓜(Caric papaya L)是三型亞雌雄異株果樹，其株性有雌株、雄株及兩性株3種類型，雌株和兩性株能結果，雄株一般不結果。按照Storey等關于番木瓜株性基因控制理論，番木瓜的株性由3個等位基因控制：M₁(雄性)、M₂(兩性)及m(雌性)。M₁和M₂為顯性，m為隱性。雄株及兩性株的基因型分別為M₁m和M₂m，雌性株的基因型為mm，基因型為M_．M₁、M₁M₂、M₂M₂合子均敗育。番木瓜通常采用實生繁殖，因而在育苗過程中出現一些“木瓜公”，即雄株。這不僅對生產造成浪費，而且在有雄株的果園留種會使以后繁殖的幼苗出現大量的雄株，只有在6~8個月后番木瓜進入開花結果期能從形態上準確判斷植株性別時才能將雄株整株斬除。因此，在苗期鑒定出植株的性別，對番木瓜育種及栽培均具有重要的意義。有人試圖采用物理、化學和組織培養的方法預測植株的性別，結果均不理想。利用分子標記技術能夠克服形態和生理生化指標受環境及發育階段影響的缺點，從分子水平上在苗期鑒定出植株的性別。Urasaki等使用RAPD標記技術鑒定番木瓜雄株、雌株和兩性株，得到一個存在于雄株和兩性株而雌株沒有的450bp條帶，并成功將其轉化為SCAR標記。Eliana等間用RAPD標記技術鑒定番木瓜Solo系列性別時，獲得一個僅存于兩性株的438bp條帶。周國輝等得到2個大小分別為1050bp和1080bp的兩性株多態性RAPD條帶。而目前在我國尚未見有獲得雄性RAPD和SCAR標記的報道。本研究參照相關的理論和方法采用RAPD和SCAR標記技術從分子水平上鑒定番木瓜株性，旨在為生產上在苗期快速準確地判斷并剔除雄株以及育種工作的早期選擇提供科學依據。

1 材料和方法

1．1 試材

供試品種為日升，種植于仲愷農業技術學院教學農場，為1年生植株，分單株采集已知性別植株幼嫩葉片，帶回實驗室保存于84℃冰箱內備用。

1．2 方法

1．2．1 DNA提取及性別DNA池的構建 采用TPS法抽提番木瓜植株DNA，提取步驟為：(1)取1g嫩葉研磨成粉末后倒入滅菌的2.0mL離心管中，加入800μL TPS提取緩沖液(含100mmoL/L Tris-HClpH 8.0，10mmoL/L EDTA pH 8.0，1moL/L KCl)在75℃中水浴40min；(2)13000r/min離心10min，取600μL上清液于1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，靜置12h；(3)13000r/min離心10min，棄上清，取沉淀；(4)加入800μL 70％的乙醇，13000r/min離心8min，棄上清，取沉淀；(5)將沉淀干燥后加入300μL 1×TE溶解。保存于4℃的冰箱備用。用UV-751型紫外分光光度計測定D_260nm/D_280nm值，判斷其純度，并采用Warburg-ehristian公式計算濃度；用已知濃度的標準樣品作為0.8％瓊脂糖凝膠電泳的對照，驗證DNA樣品的濃度并鑒定質量。根據混合分離群體分析法(BSA)原理，分別等量混合10株兩性株、雌株、雄株DNA，構成兩性、雌性、雄性DNA混合池。

1．2．2 RAPD分析 RAPD反應參照文獻[3]進行。反應總體積為25μL：10×buffer(含Mg²⁺25mmoL/L2.5μL，10堿基隨機引物(約5μmoL/L)1μL，Taq酶1.5U，10mmoL/L dN/P0.4μL，模板DNA 40～50ng，其余部分用ddH20補齊。擴增反應在THermo公司的P×2 Thermal Cycler型PCR儀上進行，擴增程序為：94℃ 1min，37℃ 2min，72℃ 1min，5個循環后改為94℃ 0.5min，37℃ 1min，72℃ 1.5min，35個循環后于72℃延伸10min。擴增產物在1.5％瓊脂糖凝膠(含0.5μgm/L EB)，0.5×TBE電解液中電泳，在紫外透射儀下觀察并照相保存。

1．2．3 特異片段的回收、克隆和測序以及SCAR標記分析 將RAPD擴增產物在1％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)，0.5×TBE電解液中電泳，然后在紫外燈下快速地將DNA特異片段從瓊脂糖凝膠上切割下來，并盡可能去除多余的瓊脂糖凝膠，將切割下來的膠塊裝入1.5mL離心管中。由北京鼎國生物工程公司協助克隆和測序。在Z18～1000片段兩端包括RAPD引物的10bp在內再延長8～12bp，設計了2對引物。利用設計的特異引物進行SCAR擴增，反應總體積為25μL：10×buffer(含Mg²⁺25mmoL/L2.5μL，2種5μmoL/L特異引物各0.5μL，taq酶1.5U， 10mmoL/L dNTP0.4μL，模板DNA40～50ng，其余部分用ddH₂O補齊。擴增反應在Thermo公司的P×2 Thermal Cycler型PCR儀上按以下程序進行：循環程序1:94℃ 1min，66℃ 2min，72℃ 1min，3個循環后改為94℃ 0.5min，66℃ 1min，72℃ 1.5min，35個循環后于72℃延伸10min；循環程序2:94℃ 1min，57℃ 2min，72℃ 1min，3個循環后改為94℃ 0.5min，57℃ 1min，72℃ 1.5min，35個循環后于72℃延伸10min。擴增產物在1.5％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)，0.5×TBE電解液中電泳，在紫外透射儀下觀察并照相保存。

2 結果與分析

2．1 番木瓜性別鑒定的RAPD標記

以雌性、兩性、雄性DNA池為模板，共篩選了214條10堿基隨機引物(上海生工生物工程公司產品)，找到1條引物Z18(序列為5-GGGCTAGTCA-3’)能在雄性DNA池中產生1條1000 bp左右的特異性的擴增帶，重復3次，結果均一致，隨機選取3種性別各5個單株DNA進行驗證，也獲得同樣結果(圖1)。將這一特異條帶命名為Z18-1000。

2．2 RAPD標記ZlS-1000的克隆、測序結果與番木瓜性別鑒定的SCAR標記

對以酶切及PCR鑒定為陽性克隆的外源插入片段進行了序列分析。序列結果如圖2，在序列的兩端均有引物Z18的結合位點，進一步證明了克隆片段的正確性。計算得知Z18-1000片段的實際堿基數為1001bp。該序列輸入NCBI(National CenterBioteehnology Information)核酸數據庫應用BLASTn和FAS7A檢索未見同源序列。已將該序列提交至GenBank GSSs(Genome Survey Sequences)數據庫，GenBank接收號為：DQ787854。為了將RAPD標記Z18-1000轉化為SCAR標記，根據序列分析結果。在原有引物Z18序列的基礎上向內延長8-12 bp設計并合成了2對特異引物。第1對引物SRl：5’GGGCTAGTCAATGTGCTAATGG3’，22 bp；SR2：5’GGGCTAGTCATCACTATCGC3’，20 bp。第2對引物為SR3：5’GGGCTAGTCAATGTGCTA3’，18 bp；SR4：5’GGGCTAGTCATCACTATCG3’，19bp。4引物的Tm值分別為：60℃、60℃、55℃、57.5℃。比較55℃、57℃、60℃、62℃、64℃、66℃不同退火溫度，并反復試驗表明利用第l對引物擴增時，在55℃、57℃、60℃、62℃、64℃的退火條件下，雌性、兩性、雄性DNA均能擴增出Z18-1000片段，其中雄性DNA的條帶強度約是雌性和兩性的2～4倍。將退火溫度提高到66℃時，僅能在雄性DNA中擴增出1000bp的特異片段(圖3)，因此，確定第1對引物的SCAR擴增退火溫度為66℃，即利用第1對引物進行SCAR擴增時使用循環程序1。利用第2對引物擴增時，在退火溫度為57℃時僅能在雄性DNA中擴增出1000 bp的特異片段(圖4)，故確定第2對引物的SCAR擴增退火溫度為57℃，即利用第2對引物進行SCAR擴增時使用循環程序2。將兩對引物擴增出的相同SCAR多態性片段統一命名為SD-1000。經反復實驗，該標記對反應條件和體系如Mg2~、模板DNA和引物濃度等不敏

3 討 論

RAPD標記技術由于操作簡便、快速、DNA用量少，在農、林、醫學及生物學的各個領域中得到廣泛應用，但是該技術有利用單引物擴增多個基因位點和對反應條件敏感等不足之處，在一定程度上限制了RAPD標記技術的發展。將RAPD標記轉化成SCAR標記可以克服此限制。目前，已有很多RAPD標記成功轉化成SCAR標記的例子，但是也有一些研究存在將RAPD標記轉化成SCAR標記時多態性消失的現象。RAPD擴增多態性可能是引物位點幾個核苷酸序列差異或擴增片段序列內結構重排的結果，由引物結合區的序列差異導致的多態性片段進行SCAR轉化時，在退火溫度不夠高、體系不夠嚴謹的情況下，可能不表現多態性。根據相關研究表明，解決SCAR轉化時多態性消失的方案主要有：(1)適當縮短引物的長度。Vidal等提出根據測序結果在10堿基隨機引物的3’端只增加4～8個堿基，可檢測到原有的多態性，同時提高了擴增的穩定性。(2)適當提高擴增時的退火溫度。(3)對于兩等位基因間單堿基的差異，可利用核酸酶裂解和變性梯度凝膠電泳等方法鑒別。本實驗同時驗證了適當提高擴增時的退火溫度和縮短引物長度這2種成功轉化RAPD標記為SCAR標記的比較有效的方法。

應用上述所獲得的RAPD標記和SCAR標記在34株已知性別的番木瓜植株上驗證，結果表明Z18-1000和SD-1000這2種標記均只在雄株出現，雌株和兩性株沒有，說明2種方法可以比較可靠地從早期幼苗中鑒定出雄株。從2種標記的特點來看，SCAR標記更加穩定、可靠。本試驗所獲得的SCAR標記SD-1000僅存在于雄株DNA中，而兩性株和雌株沒有條帶，所以在利用SCAR標記鑒定性別時，可以在PCR產物中直接加入EB，然后在紫外燈下觀察有無熒光反應來判斷PCR擴增反應結果，同時可隨機抽取部分PCR擴增反應呈陽性的產物進行電泳來檢驗快速判斷的正確性。因此，在實際生產中，可以用此簡化方法對幼苗性別進行大規模鑒定，既快速簡便，又大大降低成本。

作者簡介：任朝興，男，在讀碩士生，從事果樹生物技術研究。