一組柑橘嫁接嵌合體及其嫁接親本的形態學、遺傳學研究

摘 要：對一組柑橘周緣嵌合體(Ekuliku)及其嫁接親本(Nankan和Hamlin)的葉片和果實進行了形態學、生理學及遺傳學分析。一般柑橘嵌合體的不同部位由不同親本特定的組織層發育而來。實驗結果表明，嵌合體果實的特性并不與其同層親本的特性完全一致，嵌合體葉片橫截面的結構也與親本存在較大差異，說明在細胞層間存在著一定的相互作用。用127種隨機引物和1對STS特異性引物對嵌合體和嫁接親本作遺傳學分析，其中8種引物能得到特異性條帶，即只在嵌合體和其中的1個親本中檢測到；并且這8個引物都有很高的重現性。隨即，對這些特異性條帶作了克隆、測序和同源性比較分析。

關鍵詞：柑橘周緣嵌合體；遺傳學分析；形態分析

中圖分類號：S666 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2007)01－01－05

根據“Tunica-Corpus”的理論，高等植物的頂端分生組織由3層組織細胞層組成。周緣嵌合體的3層細胞來自不同的親本，因此，一般認為由不同層細胞演化形成的組織和器官能夠反映該細胞層對應親本的特性。對蕓苔屬植物、煙草、番茄等嵌合體的研究表明，在分生組織細胞分化階段，細胞間的相互作用確實存在。基于這種相互作用，嫁接體不但可以從親本中繼承其優良品性，更可以創造出新的特性。因此嫁接雖然是一種古老的育種方法。但仍是一種理想的育種方法。

柑橘的食用部位由LI層細胞層發育分化而來，因此周緣嵌合體在實際應用中具有較大的價值。但由于細胞層間相互作用的存在，其食用部分也受到其他2層細胞的影響。為了更好的理解嫁接親本對嫁接嵌合體的影響，以及細胞層間的相互影響，對柑橘嵌合體Ekuliku及其親本Nankan、Hamlin做了遺傳學、形態學和生理學的研究。

1 材料和方法

1．1 植物材料

嫁接嵌合體Ekuliku由Ll層親本Nankan(Citrus unshiu)和L2、L3層親本Hamlin(C.sinensis)嫁接而成，取果實和葉作為研究材料。

1．2 形態學和生理學指標測定

使用Osaka EM，DTK-1000型微切片機切片，對葉片的橫截面進行觀察，具體方法參照Zhou等的方法，樣本量則各為40枚。果實含糖量用折射儀(Brix0-20％)測得，嫁接嵌合體和親本的取樣量各為30個果。對結果進行顯著性統計分析(LeastSignificance Difference Test，P=0.05)。

1．3 RAPD分析

參考Dellaporta等方法提取葉中總DNA。PCR方法參考Zhou等的方法，并略有改進。PCR擴增程序為：94℃ 3min；94℃ 1min，37℃ 1min，72℃ 2min，40個循環；72℃ 10min。若引物為STS標記引物，則擴增程序調整為：94℃ 3min；94℃ 0.5min，55℃ 0.5min，72℃ 1min，35個循環；72℃ 10min。

1．4 對特異性條帶的克隆和測序

對具有特異性的條帶進行割膠純化回收(GenecleanⅡ，BIO 101，INC，)，并將純化產物插入pT7 blue T-載體(Novagen)中。連接后的載體再被轉入感受態的大腸桿菌(Escherichia coli，DH5α)，培養后獲得的質粒DNA用于測序。測序使用ThermoSequenase^TM cycle(Amashan)試劑盒，在自動測序儀(DSQ 1000 L；Simadzu)上完成測序。所測得序列在BLAST網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行同源性比對。

2 結果與分析

2．1 果實的形態特征和生理特性

對果實的質量、高度、直徑以及高度與直徑的比值進行了調查(表1)。除高度外，其他特征嵌合體與親本間都存在顯著差異。Nankan的質量和直徑顯著大干Ekuliku和Hamlin，Ekuliku介于兩親本之間。但由于3者的高度幾乎相同，使高度和直徑的比值呈現相反的趨勢，即Hamlin>Ekuliku>Nankan。因此，在形狀上也呈不同的形態，Nankan呈典型的扁圓體，Ekuliku和Hamlin為偏扁圓或偏圓。

柑橘嵌合體果實的小汁胞(或稱沙囊)由L1層細胞發育而來，而其外果皮(又稱色素層或黃皮層)和中果皮(又稱海綿層或白皮層)起源于L2層細胞層。圖版—1顯示了嵌合體的外果皮顏色與其L2層細胞層親本Hamlin非常接近，都顯橙色，而Nankan的外果皮色澤更偏紅。果實的橫剖面(圖版—2)也顯示了同樣的效果，即嵌合體瓤囊(包括小汁胞和瓤辦壁)的顏色與其L1層細胞親本Nankan瓤囊的顏色極為相似，都呈明顯的橘紅色，而Hamlin則為橙色。

嵌合體Ekuliku的含糖量明顯高于Nankan，雖然仍低于Hamlin，但在統計上已不存在差異(表1)。從果實的種子數量來說(種子起源于L2層細胞)，Nankan是無核柑橘，Hamlin的子粒含量平均每個果實有1.5粒，但他們嫁接的嵌合體Ekuliku的每個果實平均子粒含量達到3.8粒。

2．2 葉片形態特征

對葉形指數進行調查發現，雖然葉片結構由3層細胞構成，但嵌合體Ekuliku的葉形和其L1層親本Nankan表現出一致性，而與L2、L3層親本Hamlin有所不同，即Ekuliku和Nankan葉形鈍圓，而Hamlin葉形則較狹長(圖版-3)。

嵌合體葉片的橫截面結構與兩嫁接親本都存在明顯差異(圖版-4)。嵌合體Ekuliku的上層柵欄組織擁有2層細胞層，且細胞層間存在清晰的界限。Nankan的柵欄組織相對顯的較“無序”，沒有清晰的細胞層結構。Hamlin可以觀察到細胞層結構。但并不象Ekuliku那么整齊，即在某些部位是2層細胞層，另外一些部位則有3層細胞層，且層與層之間的界限也不太清晰。

2．3 DNA分析

127個隨機引物和1對STS標記引物被用于RAPD分析，從DNA角度分析嫁接嵌合體和親本的關系。其中有28個引物能夠得到特異性的條帶，即只在嵌合體和／或1個親本中檢測到。表2中所列的是上述28個引物中具有高度重視性的8個引物，其中只有STS標記引物和OPH20引物擴增出的各600bp左右的條帶只在嵌合體Ekuliku和Nankan中出現，而未在另一親本Hamlin中出現，即特異于Ekuliku和Nankan；其余的引物則都特異于Ekuliku和Hamlin(圖1)。

進一步對這8個特異性條帶進行測序研究。BLASTX的結果表明，由STS標記引物擴增得到的特異性序列有112個氨基酸(112aa)序列(從65aa到400aa)和煙草的可誘導細胞色素P450蛋白的氨基酸(從301aa到412aa，總長509aa)存在63％的同源性(圖2-a)。同時，根據BLAS7N的結果，另一引物A05擴增得到的特異性序列(從59nt到303nt)同柑橘中的類copia型逆轉座子序列(從3nt到246nt)存在90％的同源性(圖2-b)。

3 討 論

L1、L2、L3 3層細胞均會對柑橘的果實大小產生影響，就嵌合體而言，果實大小同時受兩親本的影響。柑橘嵌合體果實的形態特征、質量、直徑、高度與直徑的比值均與親本存在差異，而形成自己的大小、形狀等形態特點。這表明了遺傳上不同細胞層間存在的相互作用對柑橘嵌合體果實的形態影響較大。

嵌合體果實外果皮的顏色與其L2、L3層親本的顏色接近，這與前人的研究相一致，即柑橘嵌合體“NFF”和“FNN”由親本“Fukuhara orange(FFF)”和“Kawano Natsudaidai(NNN)”嫁接得到；NFF的外果皮顏色為橙色，與L2、L3層親本“FFF”類似，同樣，FNN則與親本“NNN”的外果皮顏色一致，表現為黃色。我們和Zhou等的研究結果都表明，嵌合體果實瓤囊的顏色與其L1層層源親本相同，但Sugawara等的研究發現，也有嵌合體瓤囊的顏色與其L2、L3層非層源親本的顏色相同，他們認為這是由于柑橘的食用部分(瓤囊)由小汁胞和瓤辦壁組成，而瓤辦壁由L2層，甚至有可能由L3層細胞發育而來，因此嵌合體的食用部分同時受兩親本遺傳因素的影響。

實驗結果表明，與某些數量性狀相比較，嵌合體的果皮、果肉色澤因其“忠實”于他們層源親本的性狀，而更具獨立性；而諸如一些果實質量、果實大小等性狀，其本身同時受L1、L2和L3層細胞影響，因此嵌合體的表現往往是在數值上位于兩親本的中間，可以說嵌合體的這些性狀受兩親本的相互作用更大，而很難說受哪個親本的影響更大。而另外一些數量性狀，如果實含糖量和果實子粒數則表現的更為“極端”，和層源親本相距甚大而接近非層源親本，或者在數值上表現為明顯超越兩親本的“值域”。從這個意義上說，嫁接能賦予物種新的特性，仍為一種有價值的育種方法。

前人的研究認為，L2層細胞的遺傳基因是影響雙子葉植物葉形的主要因子。本實驗中，嫁接嵌合體的葉形與其L1層層源親本更加相似，這與Zhou等閑的研究結果相一致：嵌合體NFF擁有和L1層層源親本NNN類似的葉形。而與L2、L3層層源親本有差異。葉表皮層由L1層細胞發育而來。而葉肉起源于L2、L3層細胞，但嵌合體Ekuliku的橫截面結構與兩親本都存在明顯差異。同時起源于L1、L2、L3 3層細胞的葉片，因兩親本之間的相互作用，即各細胞層間的相互作用。嵌合體葉的形態結構受到的影響更大。

STS特異性引物是由Zhou等Lq基于一段特異于柑橘嫁接親本Kawano Natsudaidai(NNN)的DNA片段而設計的。她在研究一組柑橘嫁接親本和嫁接體LFukuhara orange(FFF)，Kawano Natsudaidai(NNN)，FNN和NF因時，用隨機引物C-64(5’-CCAGATCCGAAT-3’)擴增到了特異于Kawano Natsudaidai的片段，該片段和煙草的細胞色素P450基因具有72％的同源性。我們用STS引物擴增到的片段同樣也發現和細胞色素P450基因存在著同源性。同時，該引物都未能在甜橙(Fukuhara orange and Hamlinorange)中擴增到該片段。進一步研究，則需要通過Southern雜交驗證，或者繼續擴增得到全序列。

嫁接是一種能給嫁接體帶來優良性狀的育種方法，但就嫁接親本如何影響嫁接體以及影響程度如何都還有待研究。對嫁接體和嫁接親本進行形態學和生理學分析無疑有助于理解上述問題，但遺傳學(或分子生物學)的分析或許對選擇合適的嫁接親本、培養理想的嫁接體有更直接幫助。

4 結 論

通過對柑橘周緣嵌合體Ekuliku及其嫁接親本Nankan和Hamlin的葉片、果實的形態學、生理學及遺傳學的研究表明：嫁接體果實顏色等非數量性狀受層源親本影響較大而表現出一致；而其他諸如一些果實質量、直徑、高度、子粒數等數量性狀則更多受到兩親本間相互作用的影響，而與層源親本表現出差異：由3層細胞發育而來的嫁接體葉片，其橫截面結構由于受到兩親本間相互作用的影響而與兩親本都存在較大差異，而嫁接體葉形卻和L1層親本類似：嫁接體內既含有u層層源親本特有的基因，也含有L2、L3層層源親本特有的基因，嫁接體在形態學、生理學上表現的與親本的差異和類似都存在一定的遺傳學背景。

作者簡介：吳 姍，女，博士。