紫丹活血片微生物檢查方法學驗證

摘 要：目的：建立紫丹活血片微生物限度檢查標準方法。方法：按《中國藥典》2005版的有關要求.通過接種代表性的陽性菌株，采用常規法、薄膜過濾法、稀釋法進行方法學驗證。結果：常規法對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉菌的回收率均高于70％，對枯草桿菌、白色念珠菌的回收率均低于70％。采用薄膜過濾法每筒沖洗400ml(分4次)，可以消除樣品對枯草桿菌、白色念珠菌的抗菌活性，使其正常生長；控制菌檢查采用稀釋法進行檢查。結論：本樣品可以采用薄膜過濾法及稀釋法進行測定。

關鍵詞：紫丹活血片；微生物限度檢查；常規法；薄膜過濾法；稀釋法；沖洗量；方法學驗證

中圖分類號：R927.1 文獻標識碼：A

文章編號：1007-2349(2007)12-0034-02

紫丹活血片具有活血化瘀，理氣止痛之功能.臨床用于氣滯血瘀所致胸痹(冠心病心絞痛)、眩暈(腦動脈硬化)。當建立藥品的微生物限度檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌數的測定及控制菌檢查。按《中國藥典》2005版的有關要求，通過接種代表性的陽性菌株，發現紫丹活血片具有抑菌活性，采用薄膜過濾法，可以消除紫丹活血片抑菌活性，確定了薄膜過濾法的最佳沖洗量和實驗條件，建立了微生物限度檢查方法。

1 儀器與材料

1.1儀器 HTY-Ⅲ型智能集菌儀，(杭州泰林醫療器械廠生產；開放式一次性薄膜過濾器，北京牛牛基因技術有限公司，批號：20051005)。

1.2樣品 紫丹活血片(云南天利藥業有限公司生產，規格0.4g／粒，批號20060301)。

1.3培養基 膽鹽乳糖增培養基(批號，05222)，玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號，030710)，營養瓊脂培養基(批號，050328)，改良馬丁瓊脂培養基(批號，010315)，營養肉湯培養基(批號，041010)，PH7.0氯化鈉一蛋白胨緩沖液(批號，050217)

1.4菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(F)44102]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98 003](中國藥品生物制品檢定所提供)。

2 方法驗證

微生物限度檢查的驗證實驗按中國藥典2005版微生物限度檢查法(附錄ⅪJ)常規法和薄膜過濾法進行。

2.1菌液制備 取上述經34℃培養18～24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌肉湯液體培養物1ml，加入9ml 0.9％氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10^-5～10^-7備用；取經24℃培養18～24h的白色念珠菌霉菌液體培養物1ml.加入9ml 0.9％氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10^-5備用；取經培養一周的黑曲霉菌斜面物，加0.9％氯化鈉溶液3ml，洗下孢子，轉移至另一空管，標準比濁后，取1ml加入0.9％氯化鈉溶液中10倍稀釋至10^-4備用。

2.2菌液的檢驗 取上述金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸埃希菌10^-5～10^-7稀釋液各1ml，用45℃營養瓊脂培養基20ml注皿，各平行測定兩皿，30～35℃培養48h，計數，應約為50～100cfu／ml；取上述白色念珠菌10^-5～10^-6稀釋液及上述黑曲霉菌10^-4孢子懸液各1ml，用45℃琥紅瓊脂培養基20ml注皿，各平行測定兩皿，23～28℃培養，逐日觀察計數，應約為50～100cfu／ml。結果見表1。

2.3供試液制備 取樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液100ml，混勻，取適量3000轉／分離心10min作為1:10的供試液。

2.4回收率的測定

2.4.1細菌數霉菌數常規法測定試驗組：取1:10供試液1ml、50～100cfu試驗菌同時加入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養24～72h逐日觀察結果。菌液組：測定每一菌株所加的試驗菌數(同菌液檢驗)。供試品對照組：取1:10供試液1ml加入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養24～72h逐日觀察結果，測定供試品本底菌數。

2.4.2細菌數薄膜過濾法測定 取1:10的供試液1ml，注入開放式濾器(先用少量緩沖液潤濕濾器)，用pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次100ml共4次(總沖洗400m1).加1ml(50～100cfu)試驗菌，抽干后，取出濾膜菌面朝上貼入規定瓊脂平板培養基中，置規定溫度培養48h，結果見表2。

2.5回收率的計算 按如下公式計算試驗組的加菌回收率：回收率＝(試驗組一供試品對照組)÷菌液組×100％

2.6控制菌檢查方法的驗證

2.6.1常規法 取1:10供試液10ml加入100ml膽鹽乳糖培養基中，同時加入上述大腸埃希菌液1ml，置35℃培養24h；取稀釋液10ml加入100ml膽鹽乳糖培養基，置35℃培養24h.作為陰性對照；取1:10供試液10ml加入100ml膽鹽乳糖培養基中，同時加入上述金黃色葡萄球菌液1ml，置35℃培養24h，作為陰性菌對照組。另取1:10供試液1ml加入10ml膽鹽乳糖發酵培養基中.同時加入上述大腸埃希菌液1ml.置35℃C培養24h；取稀釋液1ml加入10ml膽鹽乳糖發酵培養基中置35℃培養24h，作為陰性對照；取1:10供試液1ml加入10ml膽鹽乳糖發酵培養基中，同時加入上述金黃色葡萄球菌液1ml，置35℃培養24h，作為陰性菌對照組。

2.6.2稀釋法 取1:10供試液10ml加入200ml膽鹽乳糖培養基中，同時加入上述大腸埃希菌液1ml，置35℃培養24h；取稀釋液10ml加入200ml膽鹽乳糖培養基，置35℃培養24h，作為陰性對照；取1:10供試液10ml加入200ml膽鹽乳糖培養基中，同時加入上述金黃色葡萄球菌液1ml，置35℃培養24h，作為陰性菌對照組。

3 結果

從表2結果可以看出：該供試品接種5株陽性試驗菌株，常規法對枯草桿菌、白色念珠菌回收率均低于70％，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌回收率均高于70％；薄膜過濾法對枯草桿菌、白色念珠菌回收率均高于70％。說明該樣品具有抑菌活性，細菌數、霉菌數、酵母菌均需采用薄膜過濾法進行測定。見表3。

4 結論

從表2～3結果可以看出，通過接種5株陽性試驗菌株，經方法學驗證，細菌數、霉菌數、酵母菌均需采用薄膜過濾法進行測定；控制菌大腸埃希菌需采用稀釋法進行檢查。