基質細胞衍生因子－１α及其受體在糖尿病大鼠心肌病變中的表達及意義

林安華 雷閩湘 謝曉云 徐寒松

摘要：目的 觀察糖尿病大鼠心肌病變與基質細胞衍生因子-1α(SDF-1d)及其受體(CXCR-4)的關系。方法以鏈脲佐菌素(STZ)誘導建立糖尿病大鼠模型。隨機分為1個月病程組(M1組)、3個月病程組(M3組)、5個月病程組(M5組)。心肌切片后行SDF-1α，CXCR-4及血管內皮生長因子(VEGF)免疫組化，抗vWF抗體染色心肌微血管計數，半定量反轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)檢測SDF-1α，CXCR-4及VEGFmRNA在大鼠心肌中的表達水平。結果 隨著病程的延長，心肌組織中SDF-1α，CXCR-4袁達水平逐漸增高，與正常對照組相比，造模后1個月就有增高，5個月時增高最明顯，而心肌組織中VEGF表達無明顯改變：心肌微血管計數顯示造模后5個月心肌內微血管數量明顯減少。結論 糖尿痛心肌病變時SDF-1α/CXCR-4在心肌中的表達水平隨糖尿病痛程延長逐步增高，而VEGF表達無明顯改變，糖尿病心肌病變時微血管減少可能與VEGF表達不足有關。

關鍵詞：糖尿病；心肌病變；基質細胞衍生因子-1α；CXCR-4；大鼠

中圖分類號：R587.1 R255.4 文獻標識碼：A 文章編號：1672-1349(2007)07-0601-03

糖尿病心肌病變是由代謝紊亂觸發，致心肌細胞凋亡增加，纖維化，出現心律失常，進行性心功能不全的一種糖尿病慢性并發癥，是糖尿病病人死亡主要原因之一，心肌內微血管病變是其主要病理改變。基質細胞衍生因子(stuomal cell-derived factor-1α，SDF-1α)是趨化作用細胞因子(chemotaxis)CXC亞族的一員。研究表明，SDF-1α在細胞遷移過程中發揮著重要作用，與血管生成密切相關，通過與其特異性受體CXCR-4結合而發揮趨化作用，促進造血干/祖細胞逆SDF-1濃度梯度移行和增殖，誘導新生血管形成。在研究SDF-1α對人微血管內皮細胞的作用時發現，SDF-1α能促進內皮細胞增殖遷移，并能促進內皮細胞表達血管內皮生長因子(VEGF)，從而促進血管發生，表明SDI、1α參與了微血管內皮細胞形成新生血管的過程。本研究通過鏈脲佐菌素(STZ)誘導建立糖尿病心肌病變動物模型，應用免疫組化和RT-PCR方法研究糖尿病心肌病變心肌SDF-1α，CXCR-4及VEGF的表達，探討糖尿病心肌病變可能的發病機制。

1 材料與方法

1．1 材料 雄性SD大鼠60只，體量200g±20g，由中南大學醫學動物部提供；鏈脲佐菌素(Streptozotocin，美國Sigma公司)；羅氏血糖儀及試紙；SDF-1α，CXCR-4，VEGF及抗vWF單抗(武漢博士德公司)；S-P試劑盒(北京中杉金橋公司)；Trizol和反轉錄試劑盒(Invitrogen公司)；Taq酶(大連Takara公司)；引物(上海生物工程公司合成)；PCR擴增儀(德國Biometra公司)；UVI.pro凝膠成像與分析系統(華粵公司)。

1．2 方法 實驗大鼠隨機分成正常對照組(NC組)和糖尿病(DM組)，每組又分3個亞組，即1個月組(M1組)、3個月組(MS組)、5個月組(M5組)各10只。禁食12h后，用新鮮配置0.1mmol/L.pH4.5的枸櫞酸鹽緩沖液稀釋STZ(10.g/L)，以60mg/kg一次性腹腔內注射誘導建立糖尿病大鼠模型，正常組以等體積枸櫞酸鹽緩沖液一次性腹腔內注射。1d及3d后尾靜脈采血測血糖≥16.7mmol/L確定模型并納入試驗。每5d測大鼠體重、血糖1次，普通顆粒飼料喂養，自由飲水。

分別于造模后1個月、3個月、5個月末稱體重、測空腹血糖后處死大鼠，取心臟組織應用免疫組化S-P法檢測心肌組織SDF-1α，CXCR-4及VEGF的表達。

抗vWF抗體染色心肌微血管計數，第Ⅷ因子相關抗原在血管內皮細胞表達，應用免疫組化S-P法對各組大鼠心肌組織中第Ⅷ因子相關抗原進行測定，參照Weidner法計數心肌微血管(MV)。

取心肌置于去PdNA酶的凍存管液氮中保用于Trizol提取心肌總RNA，測定純度及含量。

1．3 統計學處理 采用SPSS 11.5進行統計學分析，結果以均數±標準差(x±s)表示，采用成組設計資料兩樣本均數比較t檢驗。

2 結果

2．1 一般狀況觀察結果 DM大鼠均成模，無血糖返回正常現象，食量、飲水量及尿量均顯著增加，同時體質量增長緩慢，并出現皮毛枯黃、皮下膿腫等。NC組大鼠無死亡，DM組大鼠在M3組、M5組各死亡1只。

2．2 心肌微血管密度(MVD)計數 第Ⅷ因子相關抗原在血管內皮細胞表達，陽性點在光鏡下為單個或呈團塊、柱狀或已分化成管腔狀的內皮細胞，細胞質呈棕黃色至棕褐色，糖尿病大鼠心肌微血管數自造模后M1組開始較NC組就有減少，但無統計學意義，M3組具有統計學意義。

2．3 SDF-1α，CXCR-4及VEGF在心肌組織中免疫組化染色鏡下見SDF-1α，CKCR-4及VEGF在正常大鼠及糖尿病大鼠均有表達，表現為心肌微血管內皮細胞胞漿及(或)胞膜棕黃色顯色，同時心肌細胞染色也可見棕黃色顯色。在DM大鼠心肌中的表達較正常大鼠為明顯且其顯色強度隨DM病程延長逐步增強。

2．4 SDF-1α.CXCR-4及VEGFmRNA的表達量 DM組大鼠心肌組織中SDF-1α，CXCR－4及VEGF mRNA的表達量與同齡NC組大鼠比較，1個月時mRNA表達就明顯升高，5個月時增高最明顯。

3 討論

SDF-1α是新近發現的具有趨化活性的細胞因子，廣泛表達于多種組織器官中。近年來研究發現它與血管新生有著密切關系，SDF-1α通過與其特異性受體CXCR-4結合，促進CD34⁺造血干／祖細胞逆SDF-1α濃度梯度移行和增殖，抑制CD34⁺造血干／祖細胞凋亡，誘導新生血管形成。Tachibana等研究CXCR-4或SDF-1基因缺乏鼠胚胎期血管系統發生過程時發現，與野生鼠比較，基因缺乏鼠在胚胎期第13.5天循環網就有區別，在野生鼠胚胎中可見腸系膜動靜脈的大小分支，而在CXCR-4基因缺乏鼠胚胎中即使血管是正常的其大的分支也被丟失，在SDF-1缺乏鼠胚胎中存在類似表現；另見CXCR-4基因缺乏鼠死于宮內并且在心血管發育中存在缺陷，因而認為SDF-1/CXCR-4是器官及血管形成的重要信號系統。SDF-1α/CXCR-4軸在CD34⁺造血干/祖細胞的歸巢過程起著重要作用，并能誘導血管內皮細胞遷移增殖。Mirshahi等研究SDF-1對人微血管內皮細胞的作用時發現，SDF-1能促進內皮細胞增殖遷移，并能促進內皮細胞表達血管內皮生長因子，從而促進血管發生，表明SDF-1參與了微血管內皮細胞形成新生血管的過程。VEGF是一類與血管內皮細胞增殖及血管新生密切相關的血小板源性蛋白，具有增加血管尤其是微血管滲透性的功能，同時還能選擇性地促進血管內皮細胞分裂進而促進血管新生。雖然正常組織也表達VEGF，但研究證實VEGF的高表達與病理性微血管異常增生關系密.切。Salcedo等研究發現VEGF能誘導人血管內皮細胞CXCR-4表達增加。Hiada等報道SDF-1α基因轉染的內皮祖細胞通過VEGF/eNOS途徑增加缺血誘導的血管形成和血管新生。阻斷SDF-1/CXCR-4軸能通過VEGF依賴性途徑抑制薪生血管形成從而延緩腫瘤的生長。SDF-1α和VEGF以協同作用機制促進卵巢癌血管新生，在用人卵巢癌細胞成瘤的小鼠實驗中發現，高濃度的SDF-1α或VEGF均能誘導腫瘤內血管發生，病理性濃度的SDF-1α和VEGF協同作用誘導腫瘤內血管發生，缺氧同步刺激腫瘤細胞產生SDF-1α和VEGF，SDF-1α和VEGF協同增強血管內皮細胞遷移、擴增和存活。

糖尿病大鼠心肌微血管結構扭曲變形、微血管數目減少且密度降低、血管內皮細胞數目減少，STZ誘導糖尿病大鼠心肌細胞超微結構的改變發生在糖尿病病程8周～12周，心功能改變發生在糖尿病病程6周～14周。本實驗用STZ大鼠飼養到20周，在3個月時糖尿病大鼠心肌內微血管數量就有明顯減少，5個月時減少更明顯，具有糖尿病心肌病的改變。本實驗免疫組化檢測SDF-1α，CXCR-4及VEGF在正常大鼠及DM大鼠的心肌均有一定的表達，測灰度值比較顯示DM組大鼠在3個月、5個月時SDF-1α、CXCR-4表達均明顯增高，但VEGF表達無明顯改變；相對光密度結果顯示SDF-1α，CXCR-4及VEGFmRNA在NC大鼠及DM大鼠的心肌亦均有一定的表達，但DM大鼠心肌中SDF-1α，CXCR-4的表達較NC大鼠為高且其增高水平隨DM病程延長逐步增加，在1個月時表達就明顯升高，5個月增高最為顯著，而VEGF表達在各病程組均較NC組無明顯差異。DM大鼠心肌病變時SDF-1α，CXCR-4表達增高，并隨病程延長而呈繼續增高趨勢，但DM大鼠心肌VEGF表達增高不足，這可能是糖尿病心肌病變時微血管減少的重要原因。

(本文編輯 王雅潔)