大鼠局灶性腦缺血再灌注后腫瘤壞死因子表達的變化及三七總皂苷的作用研究

摘要：目的 研究三七總皂苷(PNS)對局部腦缺血再灌注后腦組織中腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響，探討PNS對缺血再灌注后神經元的保護作用。方法 參照ZeaLonga線栓法制作大鼠大腦中動脈阻塞模型(MCAO)，100只SD大鼠隨機分成假手術組、缺血再灌組和PNS治療組。每組大鼠再隨機分成4組，分別在再灌注后6h，24h，48h，96h處死。用免疫組化法檢測缺血腦組織冷凍切片TNF-α的陽性表達。結果 假手術組腦內有極少量表達；缺血再灌組與PNS治療組各時間點表達明顯強于假手術組(P<0.01)，PNS治療組各時間點表達弱于缺血再灌組，陽性細胞數亦明顯減少(P<0.01)。結論 三七總皂苷對腦缺血再灌注后TNF-α的表達有降低趨勢。

關鍵詞：腦缺血；缺血再灌注；腫瘤壞死因子；三七總皂苷

中圖分類號：R743.31 R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1672-1349(2007)07-0597-03

在腦缺血再灌注損傷的重要機制之一——過度的炎癥反應中，腫瘤壞死因子(TNF-α)是主要的致炎因子。本實驗通過建立大鼠大腦中動脈阻塞模型(MCAO)腦缺血再灌注模型，觀察腦缺血后TNF-α的陽性表達以及三七總皂苷(sapomons ofpanax notogmseng，PNS)對其的影響，進一步了解PNS在腦缺血后炎性反應中的作用及意義。

1 材料與方法

1．1 材料 100只成年健康SD大鼠，體重260g～300g，由上海實驗動物中心提供。TNF-α免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，三七總皂苷由黑龍江珍寶島制藥有限公司提供。

1．2 動物分組 100只成年健康SD大鼠隨機分成3組：假手術組(20只)，缺血再灌組(40只)，PNS治療組(40只)。缺血再灌組、PNS治療組大鼠均采用左側大腦中動脈線栓法建立局部短暫腦缺血模型，缺血1h后拔出線栓頸外動脈段即為再灌注開始時間；假手術組手術操作除不插入線栓外其他同缺血再灌組，PNS治療組大鼠在線栓堵塞大腦中動脈的同時腹腔內注射PNS(50mg/kg)。分別于術后6h，24h，48h，96h處死大鼠，斷頭取腦。取額極后部分腦組織行紅四氮唑(TTC)染色，出現白色梗死區者，為MCAO模型成功。

1．3 標本制作及檢測 取腦組織后每個取材點的后腦部分冷凍切片進行。TNF-α的免疫組化檢測采用SABC染色，觀測腦組織中微血管內皮細胞上的表達，免疫組化顯色顯微鏡下觀察著色呈棕褐色為陽性。

1．4 結果判定 腦缺血后皮層及紋狀體區對缺血最敏感，損傷較明顯，故著重觀察皮層及紋狀體區細胞變化。觀察切片中陽性細胞數目及染色深淺程度。陽性結果定量，采用微量計數法(10目鏡X40目鏡)，以顯色陽性的細胞數/高倍視野表示，并用顯微鏡定量圖像分析儀進行分析。

1．5 統計學處理 應用SPSS 11.0軟件處理，計量數據以均數±標準差(x±s)表示，建立數據庫，采用方差分析及兩兩比較t檢驗。

2 結果

假手術組在大腦皮質和紋狀體等部位可觀察到TNF-α的弱陽性表達，說明正常情況下，腦內有少量的TNF-α表達，主要集中在神經元和微血管內皮細胞。缺血再灌組各時相點的TNF-α的表達較假手術組皆明顯增強(P<0.01)，自再灌注6h組開始在大腦皮質和紋狀體區等區域出現了TNF-α的強陽性表達，陽性細胞數增加，染色變強。再灌注24h組TNF-α陽性細胞數目及染色強度較6h組明顯增強(P<0.01)，至再灌注48h組最強，較再灌注24h組有統計學意義(P<0.01)，再灌注96h組表達仍較強，與48h組比較無統計學意義(P>0.05)。PNS治療組TNF-α陽性細胞的分布與缺血再灌組基本一致。PNS治療組在各時點的TNF-α表達較假手術組皆明顯增強(P<0.01)，且表達強度隨時間的變化規律與缺血再灌組相同，但是PNS治療組再灌注各時點的TNF-α的陽性表達皆明顯弱于缺血再灌組(P<0.01)。

3 討論

近年來，TNF-α在腦缺血再灌注損傷過程中的作用越來越引起人們的關注。TNF-α是一種缺血性腦損傷關鍵性介質，在中樞神經系統神經組織內不僅星形細胞、血管內皮細胞和小膠質可產生TNF—d，神經元亦可產生TNF-α。TNF-α在腦缺血損傷中的作用也是雙重的，少量的TNF-α具有中樞保護作用，TNF-α誘導線粒體合成錳超氧歧化酶(Mn-SOD)等神經保護蛋白，也能誘導星形膠質表達生長因子。TNF-α可通過抗氧化途徑保護神經細胞，增強神經元在再灌注過程中抵抗氧自由基的損害。說明TNF-α在腦組織損傷恢復及神經保護方面具有重要意義。但過量TNF-α可通過不同的機制誘導神經細胞損傷。在本研究中采用免疫組織化學的方法觀察了腦缺血再灌注時TNF-α表達。結果顯示在假手術組皮層海馬區等部位可有少量TNF-α的表達，表明正常情況下腦內即有少量TNF-α的表達，自腦缺血再灌注6hTNF-α表達增強，陽性細胞數增加與假手術組比較有統計學意義(P<0.01)，提示TNF-α異常表達參與了腦缺血再灌注損傷。隨再灌注時間的延長，TNF-α的表達逐漸增強，至再灌注48h表達最明顯。

TNF-α本身對神經元并無直接毒性作用，而是通過非神經細胞調節起作用。TNF-α的許多生物活性是通過細胞膜上受體介導的。腦缺血后不僅在神經元、巨噬細胞、膠質細胞和室管膜細胞上表達TNT-α，而且可上調TNF-α受體的表達，可在多種細胞及在血管周圍空間表達TNF-α受體，說明TNF-α參與了腦缺血后再灌注損傷。在腦缺血的病理情況下，TNF-α可通過多種不同的作用機制發揮神經毒性作用，誘導神經元損傷：①促炎性作用。與中性粒細胞有關的炎癥反應在繼發性腦損傷中起關鍵作用。TNF-α可上調細胞間黏附分子-1(ICAM－1)和選擇素等的表達，激活巨噬細胞釋放白細胞介素-1(IL-1)口]，誘導白細胞介素-8(IL-8)和白細胞介素-6(IL-6)產生，還可激活腦內的小膠質細胞、內皮細胞、巨噬細胞產生炎性代謝產物如血小板活化因子(PAF)、集落刺激因子等炎性介質，激活白細胞，加重了炎癥。②抑制核因子Kappaβ(NF-κB)的活性。增加腦細胞對TNF-α細胞毒性的敏感性。③損傷血腦屏障(BBB)。TNF-α在腦局部缺血時能增加血腦屏障通透性。④促凝作用。TNF-α可抑制內皮細胞表達血栓調節素，改變細胞表面的血凝和抗凝血機制，降低蛋白C抗凝作用，導致血管內凝血。誘導血小板活化因子、組織因子、Ⅷ因子的釋放，從而促發一些凝血因子活化。⑤誘導一氧化氮(NO)產生。TNF-α可作用于多種炎性細胞誘導一氧化氮合酶(NOS)激活，使NO合成增加，從而加重對組織的損傷。Betz等的研究也支持這一觀點，另外Zhaimi等研究證實TNF-α可直接或者通過誘導神經毒性介質如NO的產生導致梗死病灶的進展。⑥誘導凋亡的作用。通過和細胞膜上的TNFR結合，觸發信號傳導級聯導致細胞凋亡。

欣腦肽的主要成分是三七總皂苷，近年來的不少研究文獻證明，三七總皂苷能降低心肌耗氧量，改善心肌缺血，提高氧飽和度，阻止再灌流期局部腦血流量的降低，抑制再灌注蛋白激酶C的激活及鈣超載，減少自由基和興奮性氨基酸的釋放。馬麗焱等發現三七總皂苷可明顯減少缺氧／再給氧損傷時細胞內酶的釋放減輕細胞形態學改變，提高了細胞存活率。本研究結果顯示，PINS對腦缺血再灌注后腦內TNF-α的表達有極為顯著的影響，與同一時期缺血后再灌注組比較有統計學意義(P<0.01)，說明了PNS可顯著抑制腦缺血再灌注后不同時期內TNF-α的表達，降低了TNF-α的水平，從而減輕了缺血后由TNF-α介導的一系列損傷，減少神經元凋亡的發生，為臨床治療提供了新的理論依據。

(本文編輯 王雅潔)