體外誘導骨髓間充質干細胞向神經細胞分化的研究進展

項正兵 吳曉牧

中圖分類號：R392.4 文獻標識碼：A 文章編號：1672-1349(2007)07-0604-02

隨著人類胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)的使用，提出了許多倫理學上和病人特異性胚胎干細胞獲得的困難性上的問題，選擇成體干細胞作為細胞移植替代治療變得非常現實。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)作為一種自體干細胞，具有很強的自我更新、增殖能力以及多向分化的潛能。BMSC在體外不同的誘導條件下可分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱、肌肉細胞、神經細胞等多種細胞。由于BMSC有取材方便、易于體外培養擴增、植入體內不易引起免疫排異反應、不存在倫理學爭議等眾多優點，且最近的研究表明BMSC在體內、外都能被誘導成神經元樣細胞，且植入體內能改善神經功能缺損癥狀。因此，BMSC的研究越來越受到人們的關注。本文結合最新進展就體外誘導BMSC向神經元樣細胞分化的方法及其可能的機制進行綜述。

1 以抗氧化劑為基礎的誘導方案

BMSC向神經元樣細胞的分化，首先由Woodbury等報道，他們用抗氧化劑β-巰基乙醇(β-mercaptoethanoi，BME)或二甲基亞砜(dimethytsulfoxide，DMSO)／丁羥茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)等體外誘導成年大鼠和人BMSC分化。發現BMSC呈現為神經元形態，同時表達神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、神經元核抗原(neuronal nuclear antigen，NeuN)和神經微絲M(neumfilament－M，NFM)等神經細胞標志物。5h后，被誘導的細胞表達神經干細胞標志物神經巢蛋白(Nestin)；6d后，Nestin表達消失，而TrkA(一種神經生長因子受體)則在5h至6d持續表達。這提示BMSC經誘導后先分化為神經干細胞而后逐漸向成熟的神經細胞轉化。此后，這一誘導方法被廣泛用于BMSC向神經元體外分化的研究。抗氧化劑誘導作用機制尚不清楚，研究證實，活性氧在細胞增殖分化過程中起到第二信使的作用，抗氧化劑是否通過改變BMSC內的氧化還原狀態使其分化為神經細胞有待進一步研究。近年來在探討抗氧化劑誘導BMSC體外分化機制時，有的研究發現，用DMSO和BHA等化學誘導劑使BMSC在1h內誘導分化為神經元樣細胞，其實是由于細胞骨架結構肌動蛋白斷裂、細胞收縮而產生的一種現象。Lu等也證明，在BME或DMSO／BHA誘導BMSC分化過程中，在不同時間點對鏡下相同視野觀察，形成的所謂神經元樣細胞的突起是細胞延長部分收縮而成。化學誘導劑誘導神經元樣細胞形成可能是化學物質產生的毒性使細胞收縮或細胞骨架變化的結果，并不能代表復雜的細胞分化進程。

2 以提高胞內cAMP為基礎的誘導方案

Deng等聯合應用異丁甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine，IBMX)和雙丁酰環腺苷酸(dibutyryl cvclicAMP，dbcAMP)提高BMSC胞內cAMP的含量，6d后，發現約25％的BMSC在形態上轉變為神經樣細胞。最近Long等用NEUROBASAL培養液誘導BMSC向神經細胞分化，即在dbcAMP和IBMX以提高胞內cAMP基礎上加入新的細胞因子如腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、人表皮生長因子(human epidermal growth factor，hEGF)和堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，hFGF)。誘導6d，66％的細胞具有典型的神經細胞樹突形態，免疫組化和反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)證實部分細胞表達早期的神經標記物(如Nestin和β微管蛋白Ⅲ)，也有細胞表達成熟神經細胞的標記物，如神經絲蛋白(neurofilament，NF)，NeuN，Tau，膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。關于提高胞內camP濃度能促使BMSC向神經細胞的分化的機制，有人認為可能與cAMP能激活PICA或p38，ERK1/2等信號途徑有關。最近Jori等認為除了胞內cAMP濃度的增加會激活經典的PKA途徑從而影響BMSC向神經細胞的分化外，MEK-ERK信號等也和BMSC向神經細胞誘導分化有關。此外，cAMP還可引起POU家族轉錄因子Brn-3a表達的增加。Brn-3a在神經元的早期分化中起關鍵作用，它調控了NF，α-intexnextin等多種神經軸突骨架蛋白的表達。

3 以細胞生長因子為基礎的誘導方案

細胞的增殖和分化受各種生長因子的影響，在這些因素中，神經營養因子的作用尤為關鍵。Smmhez-iarrlos等建立了主要以神經營養因子V為基礎的誘導BMSC分化為神經細胞的培養體系，誘導7d～14d后，發現有BMSC分化為神經細胞。近年研究顯示，EGF，bFGF，BDNF和膠質細胞源性神經營養因子(glial-derived neumtrophic factor，GDNF)等因子在BMSC向神經細胞分化中起著重要的作用，已有科學家利用DNA測序方法檢出這些細胞因子的受體存在于BMSC的細胞膜上，因而有人推測這些因子與其相應受體結合后，可將有關信號轉導致細胞質或細胞核內，從而發揮對細胞的調控作用，但確切機制尚不清楚。bFGF是體內重要的神經營養因子，可促使神經干細胞增殖并決定其分化方向，并具有加快膠原降解，恢復凋亡細胞活力等重要功能。它可能參與BMSC向神經元分化的啟動，是一種有效的有絲分裂原和分化抑制因子，可影響中胚層、神經外胚層的細胞增殖和分化。Kim等發現，FGF和維甲酸(retmoic acid，RA)誘導人BMSC后，16％的細胞表達NF。BDNF在神經細胞發育、存活及損傷修復中起關鍵作用，對BMSC在體外向神經細胞分化具有明顯的促進作用。

4 以維甲酸(RA)為基礎的誘導方案

RA是一種重要的形態發生素，在胚胎期對胚胎干細胞(ESC)向神經細胞分化起重要作用。有研究表明RA能誘導ESC向神經細胞分化，隨著濃度的不同而變化，低濃度RA誘導ESG分化為神經前體細胞，高濃度RA促進神經前體細胞分化為成熟的神經元和膠質細胞。離體的研究表明RA在神經系統各部位的發育也起重要的作用。RA促進神經系統背腹側、首尾端的形成。此作用也因RA濃度不同而變化。低濃度RA誘導擬胚體細胞主要向腹側表型分化，而高濃度RA誘導擬胚體細胞背側化。RT-PCR顯示低濃度RA處理組的擬胚體細胞中后腦特異性標志物(otxl，otx2，en1，hoxb1，hoxa2)陽性，而脊髓神經標志物陰性。濃度RA處理組后腦和頭端脊髓標志物(hoxc4，hoxc5，hoxc6)表達增加，前腦和中腦標志物表達降低。高濃度RA誘導ESC分化為后腦和脊髓軀體運動神經元；而低濃度RA誘導ESC分化為后腦內臟運動神經元或支配上肢的軀體運動神經元。低濃度RA可誘導腹側化，在此過程中音猬因于(sonic hedgehog，ShE)表達水平升高有關。Wichterie等用RA和Shh或Shh激動劑Hh-ag1.3聯合處理擬胚體可誘導ESC分化為運動神經元，該作用隨Hh Ag 1 3濃度增加而增加，而RA聯用Hh抗體，則檢測不到運動神經元的分化。可見RA和Shh均是在神經發育過程中的重要因子，在MN的形成中有不可或缺的作用。目前已有使用RA與抗氧化劑或細胞因子聯合成功誘導BMSC向神經元細胞分化的報道。但是有關使用RA和Shh成功分化為MN的研究對象都是ESC，尚未見BMSC向MN分化的報道，因此，成功誘導BMSC分化為功能性神經元將具有重要意義。2005年，Kondo等D0]的研究表明BMSC內能表達RA受體(RAR)及Shh信號傳導途徑的一些分子。BMSC預先經FGF₂和福斯高林(一種血小板凝集抑制劑)處理后，再經RA和Shh聯合誘導后的BMSC能表達谷氨酸能感覺神經元的標志物，BMSC的可塑性進一步被證實。認為其機制可能是RA與細胞核內的RAR結合進而調控一系列基因表達，使細胞表型和分化發生改變。另外將BMSC置于胚胎10d的腦／體節／聽泡條件培養液時，發現BMSC中感覺神經元的標志物上調和促進突起生長。提示在適當的體內模擬環境下BMSC可向特點的神經元分化。有可能將來代替ESC，以避免使用ESC引起倫理學爭議。

5 BMSC在體外與神經細胞共培養方案

BMSC除了在上述誘導劑、細胞因子等的刺激作用下能向神經細胞分化外，BMSC與神經細胞混合培養時也能使BMSC分化為神經元細胞，且分化率升高。如將BMSC與新生胎鼠腦組胞共同培養時，其向神經元分化的能力遠大于BMSC單獨培養的結果，NSE和NF的表達顯著增高，這說明細胞與細胞之間的相互接觸也是BMSC分化的一個重要原因。有研究將星形膠質細胞與BMSC共培養時，發現星形膠質細胞能夠明顯促進BMSC向神經元方向分化，這是因為星形膠質細胞不僅對神經元有支持營養作用，它還能釋放一系列神經營養因子、生長因子等，從而主動參與神經元信息處理過程，調控神經干細胞的分化，刺激神經元的產生。說明腦內局部微環境在BMSC移植入體內分化成神經元的過程起著重要的作用。

盡管BMSC向神經細胞分化的研究已獲得了一些令人鼓舞的結果，但仍有一些問題亟待解決。①BMSC的分離、純化，實驗證明體外的BMSC均為多種細胞的混雜，如何才能有效地獲得純的BMSC，有待對BMSC的細胞學特點和分化各階段細胞標志物的進一步研究；②體外BMSC向神經細胞誘導分化模式和分子調控機制還不甚清楚，尤其是最近有學者對長期公認的DMSO等抗氧化劑誘導結果提出了置疑，需要進一步探討可行、可靠的誘導方法，且對誘導分化的神經細胞的鑒定不應僅限于形態學和細胞標記物，還應證實存在其他神經元功能的標志，如突觸的結構和功能、動作電位和突觸釋放神經遞質等；③細胞移植替代治療的安全性如何?如何既能控制增殖，避免形成腫瘤，又能在適當的時候啟動所需的分化路徑，還有待進一步研究。而這些問題的解決以及人們對BMSC的研究進一步深入，必將使BMSC在細胞移植替代治療中的應用走上一個新的臺階。

(本文編輯 王雅潔)