人α１胸腺素基因克隆及表達載體的構(gòu)建

摘 要 目的：為人α1胸腺素基因的蛋白質(zhì)表達奠定基礎(chǔ)。方法：用Trizol法提取人α1胸腺素RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以已知胸腺素基因為模板，在編碼區(qū)上游和下游分別設(shè)計合成一對含有EcoRI和BamHI酶切位點的寡聚核甘引物擴增Tα1克隆到PUC19載體中，雙酶切后回收連接到表達大腸桿菌DH25中表達。以堿裂解法提取重組質(zhì)粒雙脫氧鏈法序列測定。結(jié)果：成功構(gòu)建了Tα1克隆重組體PUC19-Tα1，經(jīng)序列分析證實對碼序列無誤。結(jié)論：Tα1在 DH25中表達成功。

關(guān)鍵詞 胸腺素 基因 克隆 表達

資料和方法

材料：①DH25為中科院微生物所保種，PUC19購自Promega公司，酵母菌、蛋白胨系OXOID公司產(chǎn)品。②主要試劑 Trizol和REMI1640購自Gibco公司。Taq聚合物、T4DNA酶為MBI公司，EcoRI、BamHI、TEMED購自寶令曼公司。AMV及baffer購自Pharmacia公司。MarksPBR322DNA/HaeⅢ購自華美生物工程公司。FCS為Hyclone公司產(chǎn)品。瓊脂糖、丙烯酰胺N，N'-亞甲基丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品。Alkalnie Phospllatase、RT-PCR試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。

胸腺上皮細胞（TEC）培養(yǎng)：取5個月引產(chǎn)胎兒，無菌條件下取其胸腺，以PBS凈去包膜與RBC，將其剪成1mm3以下組織塊，以PBS沖洗2次，再用REMI1640洗滌2次，棄液后平鋪于50ml培養(yǎng)瓶壁上。每瓶2～3塊。加入REM1640（含10%FCS）細胞培養(yǎng)液3ml（加入量以組織塊不浮起為限），放37℃5%CO2體積濃度條件下培養(yǎng)，24小時后換液，以后隔日換液1次。

RNA提取與測定：①收集14天的人胎胸腺上皮細胞，經(jīng)PBS洗滌后，以REMI1640調(diào)成細胞數(shù)為5×106/ml移入Eppeudorf 管中，加入1ml的Trizo1試劑，余下步驟按照試劑盒說明書提供程序進行。待真空干燥，去除樣品中的乙醇-20℃保存，以適量DEPC處理水溶解沉淀30μl，測定OD值與 RNA純度。②RNA測定：取3μl已提取的總RNA加入比色杯中，用 DEPC水稀釋至300μl進行比色，分光光度計為Pharmacia測定260nm和280nm吸光度。結(jié)果：A260/A280=1.88，RNA含量為6.9μg/ml×100。③鑒定電泳：以1%甲醛變性膠為凝膠板，0.5×TBE為電泳緩沖液。吸2μl RNA上樣緩沖液，離心混勻上樣6U/cm2電泳2小時。結(jié)果：暗室紫外燈下可見18S與28S的2條RNA條帶。

引物設(shè)計：根據(jù)已知人α1胸腺素基因序列使用計算機設(shè)計一對引物，使上下游引物分別含有EcoRI和BamHI酶切位點。上游引物P1：5′CGGAATTCCATATGTGAGACGCAGCCGCAG3′。下游引物：5′CGGGATCCTAGATTTTCTGCCTCTTCCACC３′。

RT-PCR：①逆轉(zhuǎn)錄：在微量離心管中依次加入RNA10μg10×Baffer 5μl（0.5mol/L，pH7.6，Triscl 0.7mol/L，KCl 0.15mol/L，MgCl2 0.1mol/L，DTT2U），5mmol/d，NTP混合物10μl，引物P1 2μl，引物P2 2μl，RNA抑制酶25U，AMV 2μl（20U）加DEPC水至50μl，混勻放42℃溫浴2小時。②擴增：取0.5mlEppeudorf 管依次加入上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.2μl，10×Baffer 5μl，2.5mol/L，Dntp 5μl混勻，放入PE9600 PCR擴增儀。擴增條件：預(yù)變性94℃3分鐘，然后按94℃２秒、53℃２秒、72℃１５秒，循環(huán)擴增30次，最后一次延伸72℃7分鐘，擴增結(jié)束。擴增產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖電泳，以PBR 322DNA/HaeⅢ為分子量標識鑒定擴增產(chǎn)物，并將陽性條帶切膠洗脫乙醇，沉淀后-20℃保存。

重組Tα1DNA克隆載體的構(gòu)建與表達：①將PUC19質(zhì)粒和PCR擴增的Tα1DNA片段分別用EcoRI和BamHI進行雙酶切，電泳回收DNA片段，經(jīng)過酚、氯仿抽提后-20℃凍存用于連接。②連接：目的基因小片段5μl載體1μl，10×Ligase

Baffer 10μl，T4DNA Ligase 1μl（3U）超純水11μl混合后16℃連接過夜。③轉(zhuǎn)化：取連接物10μl及減法制備的大腸埃希菌DH25混合，經(jīng)冰上冷置和42℃熱擊90秒后，取20μl涂AMP平板，37℃培養(yǎng)過夜進行藍/白菌落篩選。挑出白色菌落再（擴增）培養(yǎng)，以堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，進行酶切、電泳與序列測定。

結(jié) 果

以10%瓊脂糖電泳在100bp處可見重組DNA條帶，經(jīng)間接雙脫氧技術(shù)終止法進行序列分析，其結(jié)果與人α1胸腺素序列完全一致。

討 論

人α1胸腺素源于胸腺組分5（TF5），其中，α、β干擾素（IFN），白細胞介素2（IL2）和白細胞介素3（IL3）的增加為Tα1抗病毒提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。同時還發(fā)現(xiàn)Tα1對高親和力的淋巴因子的受體具有上調(diào)作用。早期研究表明^[1]，Tα1能誘導(dǎo)切除胸腺小鼠的骨髓和淋巴細胞表達成熟T細胞的標志，因此能增強經(jīng)刀豆蛋白A激活的小鼠淋巴細胞分泌IL2 和增強IL2受體的表達。這充分顯示出Tα1廣泛的生物活性，因而被看作是一種生物反應(yīng)調(diào)解劑，而且在人和動物間無種屬差異。Tα1如此重要的生物學作用引起國內(nèi)外學者的廣泛重視。如何能獲得純化的Tα1，多年來也成為專家學者的主攻方向。但是利用生化技術(shù)從動物胸腺中提取Tα1不但成本高，且純度也差，化學合成的Tα1也存在同樣的弊病。因此利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)獲取基因重組Tα1不但能降低成本、大量生產(chǎn)，同時更能廣泛應(yīng)用于臨床。我們應(yīng)用分子克隆技術(shù)從人的胸腺上皮細胞中成功提取了Tα1基因片段，并成功進行重組克隆和表達經(jīng)序列分析鑒定，與已知序列完全吻合，這給下一步蛋白質(zhì)的表達奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻

1吳蕾，韓兵，等.胸腺素α1的Fmoc固相合成法.化學工業(yè)與工程，2001，6

2 徐峰，陳智，等.人胸腺素α1原核表達重組體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達.浙江大學學報醫(yī)學版，2001，20