紫草多糖對Ｓ₁₈₀荷瘤小鼠紅細胞膜流動性與帶３蛋白的影響

摘 要:目的：觀察紫草多糖對S₁₈₀荷瘤小鼠瘤重、紅細胞膜流動性和帶3蛋白含量的影響。方法：采用熒光探針DPH標記法測定紅細胞膜的熒光偏振度P，計算微黏度(η)與膜脂流動性(LFU)；電泳法測定紅細胞膜帶3蛋白含量。結果：紫草多糖中劑量組抑瘤率達43.05%；且各劑量組對紅細胞膜膜脂流動性、帶3蛋白均有影響，以中劑量組效果最佳，與對照組相比P<0.01，P<0.05。結論：紫草多糖通過影響荷瘤小鼠紅細胞膜流動性和帶3蛋白恢復紅細胞的正常功能發(fā)揮其抗腫瘤作用。

關鍵詞：紫草多糖；抑瘤率；紅細胞膜膜脂流動性；紅細胞膜帶3蛋白

中圖分類號：R969.1文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2007）09-030-04

自20世紀起，免疫學理論與技術開始用于腫瘤研究，對腫瘤細胞及其代謝產(chǎn)物有了一些重要發(fā)現(xiàn)。作為機體免疫系統(tǒng)，白細胞的免疫功能早已為人們所熟悉，而紅細胞則一直被認為只是攜帶氧氣和調(diào)節(jié)血液pH作用^[1]。而現(xiàn)已公認，紅細胞免疫在機體抗腫瘤中起著重要作用。

紫草粗多糖是紫草水溶性提取物，多糖含量在30%左右。董建英^[2]從紫草根水煎劑中提取有效成分——紫草多糖對機體具有增強特異性和非特異性免疫的作用。紫草多糖還具有非特異性的抗炎作用，提高單核巨噬細胞吞噬功能的作用，提高血小板聚集的趨向，降低全血粘度的作用^[3]。但是，紫草多糖的抗腫瘤作用卻沒有報道。我們在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)紫草粗多糖對S₁₈₀荷瘤小鼠有很好的抗腫瘤效果，抑瘤率高達43.05%，于是從紅細胞免疫的角度出發(fā)，研究紅細胞膜流動性和帶3蛋白含量的變化，為紫草多糖體內(nèi)抗腫瘤的研究機制提供理論基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及瘤株

昆明種小鼠18~22g（雌雄各半），S₁₈₀（肉瘤）均購于哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所。

1.2 實驗藥品

紫草多糖（ZCP）：徐州弘康科技有限公司，生理鹽水溶解，置冰箱備用。

1.3 主要實驗儀器

低溫高速離心機(BECKMAN AvantiTM68 centrifuge)；電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；熒光分光光度計（RF-540，日本島津公司生產(chǎn)）；電泳儀（美國，Bio-Rad）；凝膠成像系統(tǒng)（美國，Bio-Rad Gel Doc1000）；752紫外-可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司）。

1.4 主要試劑

黃芪多糖（APS）：由哈爾濱商業(yè)大學博士后工作站提供；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；DPH(Sigma公司生產(chǎn))；丙烯酰胺；甲叉丙烯酰胺；十二烷基硫酸鈉；四甲基乙二胺；過硫酸銨等。

2 實驗方法

2.1 小鼠模型、給藥及抑瘤率的測定

選用昆明種小鼠，體重（18~22g），雌雄各半。將小鼠隨機分為6組，每組8只。無菌條件下抽取接種第7天的S₁₈₀荷瘤小鼠腹水(癌細胞數(shù)>95%)，用無菌生理鹽水1∶4稀釋，按0.2ml/只(4×107個細胞/ml)，小鼠右前肢腋部皮下接種，接種24小時后，分別對6組小鼠進行腹腔給藥。分別為ZCP高（400mg/kg）、中（200mg/kg）、低（100mg/kg）劑量組，黃芪多糖（100mg/kg）組，陰性對照組給相同體積的生理鹽水，0.2ml/20g，1次/d，連續(xù)給藥7d，停藥24小時后處死，分別稱取小鼠體重瘤塊重，計算抑瘤率進行三次重復實驗。

2.2 小鼠紅細胞膜的制備

取上述處死前小鼠新鮮血液3000r/min離心5min，棄上清液，加PBS緩沖液3000r/min離心5min，洗滌3次，再以1∶1比例懸浮于PBS制成紅細胞懸液，血球計數(shù)板計數(shù)。

紅細胞懸液加入低滲Tris-HCI溶液，同時加入蛋白酶抑制劑對甲苯磺酰氟(PMSF)，4℃溶血12h，將所得紅細胞溶血液以12000r/min，4℃離心15min，棄上清液，低滲Tris-HCI溶液洗滌3次，同上離心，吸取白色沉淀物，最后1∶1懸浮在pH7.4 PBS緩沖液中。

2.3 膜蛋白定量-考馬斯亮藍試劑盒進行測定

根據(jù)原始蛋白濃度值，將樣品最終稀釋至1mg/mL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 小鼠紅細胞膜流動性的測定^[4]

（1）細胞膜的熒光標記：取一定量新配制的2mmol/L DPH(Sigma公司生產(chǎn))四氫呋喃液分別加入到0.5ml RBC膜緩沖液中，25℃溫浴30min，用PBS液洗滌1次，最后將細胞懸浮于PBS液中，即得DPH標記的細胞膜。

（2）熒光偏振度的測定：本實驗采用日本島津公司生產(chǎn)的RF-540熒光分光光度計測熒光偏振度。激發(fā)波長λex362nm，發(fā)射波長λem432nm，狹縫10nm，測溫25℃，計算偏振度(P)、微粘度(η)和膜脂流動性(LFU)。

η=2P/0.46-P；LFU=（0.5-P）/P2

2.5 小鼠紅細胞膜帶3蛋白含量的測定(十二烷基

硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE)

（1）制膠。按表1，根據(jù)所需濃度，按比例取各種試劑，混勻，將凝膠溶液平穩(wěn)地注入兩層玻璃中，再在液面上小心注入一層水(2~3cm高)，以隔絕空氣，靜置直至凝膠的形成。

待分離膠完全聚合(膠層與上面的水相或水飽和異丁醇之間有明顯的界面)，吸凈上層液體。按比例混勻濃縮膠的各成分，以連續(xù)平穩(wěn)的流速在分離膠上面注入濃縮膠液至玻板頂端，然后小心插入梳子，注意不得在齒尖留有氣泡。

待濃縮膠至完全聚合后，取梳子、夾子以及環(huán)繞在玻板周圍的乳膠條，注意不要改變兩塊玻板的相對位置。將此凝膠板安置于電泳槽中，在電泳上、下槽即兩側電極槽中注入電泳緩沖液，注意緩沖液與凝膠上下兩端之間不要有氣泡。氣體可用尖端彎曲的滴管排出。

（2）上樣。緩沖液按1∶1或1∶2比例與蛋白質(zhì)樣品混勻，100℃保溫3~5分鐘，冷卻至室溫。先在凝膠玻璃上做記號，用微量進樣器分別吸取膜樣品20μl。加樣完畢后，立即用電極槽緩沖液進行覆蓋，這樣在接著加上下槽電極緩沖液時，可以使樣品免受干擾。

（3）電泳。接通電源，打開電源開關，調(diào)節(jié)電流至20mA，以恒電流方式電泳，當指示染料溴酚藍(BPB)遷移到凝膠下端附近，約距下端1cm左右時，關閉電源，停止電泳。

（4）染色。將凝膠浸入染色液［0.1%考馬斯亮藍R-250(CBB R-250)、40%甲醇、10%冰醋酸］中，染色0.5~1h，棄去染色液。加入脫色液(20%甲醇、10%冰醋酸)，脫色1~3h，其間更換2~3次脫色液，然后將膠浸泡脫色液中過夜，至背景透明清楚為止。

（5）拍照。將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照，應用GIS軟件進行Band-3含量分析。

2.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS11.5軟件處理。各組數(shù)據(jù)以χ±s表示，樣本比較采用方差檢驗。

3 實驗結果

3.1 紫草多糖對S₁₈₀荷瘤小鼠瘤重的影響

ZCP對S₁₈₀荷瘤小鼠瘤重的影響（如表2），ZCP對S₁₈₀荷瘤小鼠表現(xiàn)出不同程度的抑瘤作用。與生理鹽水組比較，低、中劑量組對S₁₈₀荷瘤小鼠表現(xiàn)出較好的抑瘤作用，有顯著性差異（P<0.01）；高劑量組有差異（P<0.05），與陽性對照組比較，ZCP中劑量組與黃芪多糖組效果相比，抑瘤率略有提高。

3.2 紫草多糖對S₁₈₀荷瘤小鼠紅細胞膜膜脂流動性的影響

結果見表3，ZCP組對荷瘤小鼠紅細胞膜脂流動性有明顯影響。與生理鹽水對照組相比：其中低、中劑量組有明顯差異（P<0.01），高劑量組有差異（P<0.05）；與陽性對照組相比稍好于黃芪多糖組。

3.3 紫草多糖對S₁₈₀荷瘤小鼠紅細胞膜帶3蛋白含量的影響

結果見表4，ZCP組對荷瘤小鼠紅細胞膜帶3蛋白的含量有顯著影響。與生理鹽水對照組比：其中中劑量組有明顯差異（P<0.01），低劑量組有差異（P<0.05）；與陽性對照組比較遠強于黃芪多糖。

4 討論

本文通過觀察惡性腫瘤療效評定的指標瘤體變化的情況來看，紫草粗多糖對提高荷瘤小鼠的抑瘤率有明顯影響。與生理鹽水組比較，低、中劑量組有明顯差異。結果提示，紫草粗多糖能改變荷瘤小鼠的瘤重，初步表明具有一定的抗腫瘤作用。

細胞膜流動性是生物膜結構的一個基本特性，是指膜質(zhì)的流動性和膜蛋白的運動性。紅細胞膜呈現(xiàn)“液態(tài)鑲嵌”結構，“液態(tài)”表現(xiàn)為脂雙層的流動性，“鑲嵌”則表現(xiàn)為有些膜蛋白分子存在于或穿越脂雙層，膜蛋白具有傳遞信息和維持細胞形態(tài)等多種功能，脂雙層的流動性也具有十分重要的生理意義^[5]。

細胞質(zhì)膜適宜的流動性是質(zhì)膜行使功能的必要條件，它與細胞的通透性，信息傳遞，物質(zhì)的能量交換等多種功能具有密切的關系。因此，膜流動性是反映細胞功能狀態(tài)的一項重要而敏感的指標。而膜蛋白是生物膜功能的主要體現(xiàn)者，因此，針對膜蛋白的研究成為最近的生命科學研究熱點。在紅細胞膜上，帶3蛋白是含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占紅細胞膜蛋白含量的25%。帶3蛋白是陰離子交換蛋白家族中的一員，它調(diào)控C1-和HC03-的跨膜交換，對于呼吸過程中的CO2運輸起著至關重要的作用^[6]。Band-3除具有陰離子交換功能外，還參與紅細胞骨架的形成、調(diào)節(jié)血紅蛋白攜氧能力、調(diào)節(jié)糖酵解酶活性等功能。

施巖等^[7]的研究表明膜蛋白分子的改變將會影響膜脂的流動性，證明了細胞膜蛋白與脂層共生共存以及相互影響的關系；提出某些改變細胞膜流動性的外來因素有可能先作用于膜蛋白，通過膜蛋白的改變來導致脂雙層的流動性。

出于考察紅細胞膜上的含量最豐富的蛋白質(zhì)——帶3蛋白含量與膜流動性的相互作用，進行了本實驗。結果表明，紫草多糖組能明顯提高荷瘤小鼠紅細胞膜流動性和帶3蛋白含量。一方面，通過提高帶3蛋白含量，促進了膜流動性的增加。反之，脂質(zhì)流動性升高，嵌入的膜蛋白暴露于水相的部分會相應增加，影響膜蛋白的功能。膜蛋白與膜質(zhì)的相互作用共同調(diào)節(jié)著紅細胞的功能，使紅細胞更好地發(fā)揮體內(nèi)天然的免疫功能，在機體抗腫瘤中起到重要的作用。

參考文獻：

［1］ 郭峰，郭健.腫瘤紅細胞免疫學研究［M］.濟南：濟南出版社，1997.

［2］ 董建英.紫草多糖對小鼠免疫機能的調(diào)節(jié)作用［J］.中國實驗臨床免疫學雜志，1995，7(5):42-44.

［3］ 盧賀起.紫草多糖粗提物的藥效作用研究［J］.中國藥理學會通訊，2000，17(4):26.

［4］ 陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993.

［5］ 林克椿.細胞膜的流動性［J］.生理科學進展，1985，16（1）:83.

［6］ 施巖，楊建中，周子亮.紅細胞膜蛋白結構變化對膜脂流動性的影響［J］.承德醫(yī)學院學報，2002，19（2）：94-95.

Influence of Polysaccharides of Lithospermum Erythrorhizon on Fluidity

and Band-3 Protein Level of Red Cells Membrance of S180 Mice

Zhang Xiujuan ，Mu Kun ， Yang Shanshan， Ji Yubin

(Center of Reserch Development on Life Science and Environmental Sciences，

Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China)

Abstract:Objective:To observe the influences of polysaccharides of Lithospermum erythrorhizon on fluidity and band-3 protein level of red cells membrance of S180 mice.

Method: The fluorescence polarization (P) of red cells was determinend by DPH as probe marking and accounted the microviscosity(η) and membrane fluidity(LFU); the level of band-3 protein was determined by electrophoretic method.

Results:Inhibition rate of tumor weight of the middle dose groupwas arrived at 43.05%， and wasinfluenced theerythrocyte membrane fluidity and band-3 protein level (P<0.01， P<0.05). Conclusion: The antitumour actions of polysaccharides of Lithospermum erythrorhizon may be influenced the erythrocyte membrane fluidity and band-3 protein function to recover cell normal function and resist tumor action .

Key word: Polysaccharides of Lithospermum erythrorhizon; The rate of inhibiting tumour weight; Erythrocyte membrane fluidity; Erythrocyte membrane band-3 protein level

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。”