湖北地方小麥品種大頭黃低分子量麥谷蛋白亞基基因的分子克隆

摘要：采用PCR方法從湖北地方小麥品種大頭黃(ZM11217)中克隆得到1個低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)基因LMW-ZM11217。該基因具有LMW-GS基因的典型結構特征，編碼區長度為870bp，編碼288個氨基酸。推導的氨基酸序列比較結果表明，LMW-ZM11217與Glu-A3和Glu-D3位點控制的基因具有較高的相似性(最高相似性分別為82%和83%)，而與Glu-B3位點控制的基因具有較低的相似性(最高相似性為74%)。

關鍵詞：小麥地方品種；大頭黃(ZM11217)；低分子量麥谷蛋白亞基；基因克隆

中圖分類號：S512；Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2008)05-0489-04

Molecular Cloning of Low Molecular Weight Glutenin Gene from Hubei Wheat Landrace ZM11217

FANG Jing-ye1，LI San-he2，LI Zong-jin1，LIU Yong1，WANG Yue-Sheng1，HE Guang-yuan1

(1.China-UK HUST-RRes Genetic Engineering and Genomics Joint Laboratory，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China；2. Food Crops institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China)

Abstract：Using PCR method，the coding sequences of a low molecular weight glutenin (LMW-GS) gene，LMW-ZM11217，was isolated from Hubei wheat landrace accession ZM11217. It had a coding region of 870 bp，and encoded a mature protein of 288 amino acids. LMW-ZM11217 was a typical LMW-GS gene. Comparison of the deduced amino acid sequence showed that LMW-ZM11217 had higher similarity with genes at Glu-A3 and Glu-D3 locus (with the highest similarity 82%和83%，respectively)，whereas it had lower similarity with genes at Glu-D3 locus (with the highest similarity 74%).

Key words：wheat landrace；Datouhuang(ZM11217)；low molecular weight glutenin subunit；gene cloning

麥谷蛋白和麥醇溶蛋白是小麥胚乳中的兩類主要貯藏蛋白。麥谷蛋白又分為高分子量麥谷蛋白(HMW)和分子量麥谷蛋白(LMW)。在普通小麥(T. aestivum，AABBDD，2n=6x=42)中，低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)主要受1A、1B和1D染色體短臂上的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位點控制，統稱Glu-3位點[1]。其中，LMW-GS約占種子貯藏總蛋白的40%，其通過分子間二硫鍵結合到以高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)為骨架的麥谷蛋白聚合體中，影響面筋的強度和彈性，進而影響面包的烘烤品質。不少研究表明LMW-GS對小麥加工品質有著重要影響[2-4]。目前已分離的LMW-GS基因在編碼區的結構上非常相似，由信號肽、N-末端區、可重復短肽組成的重復區以及C-末端保守區構成[5]。LMW-GS基因兩端具有高度的保守性，使得通過PCR方法對其進行分離和鑒定具有可行性，并為對LMW-GS基因的研究提供了方便。D’Ovidio等[6]于1992年根據已知LMW-GS基因序列設計引物，首次利用PCR方法分離出單個的LMW-GS基因。

由于地處長江中游南北過渡地帶，湖北全省境內區域性氣候差異十分明顯，有著豐富的小麥地方品種。這些地方品種具有抗寒性較強、耐貧瘠、耐濕、抗穗發芽和赤霉病較輕等優點。它們都曾在長期的小麥生產中起到重要作用，因此在小麥品種改良上具有重要的潛在利用價值[7]。劉勇等[8]對111份湖北地方小麥品種的HMW-GS的遺傳多樣性進行了研究，發現湖北地方小麥品種的HMW-GS存在較高的遺傳多樣性，并發現僅有1份湖北地方小麥品種ZM11217具有優質亞基1Dx5+1Dy10，因此推測ZM11217可能具有良好的品質效應。為能有效利用這份材料，我們對其進行了LMW-GS基因克隆和品質測試。本研究中報道了從ZM11217中分離克隆的LMW-GS基因。

1 材料與方法

1.1 材料

湖北地方小麥品種大頭黃(編號為ZM11217)由湖北省農業科學院糧食作物研究所張其昌提供。

1.2 基因組總DNA提取

ZM11217基因組DNA的提取按汪越勝等[9]方法進行。

1.3 小麥地方品種LMW-GS基因編碼區的擴增

根據已發表的LMW-GS基因(Gen Bank登錄號為X13306)，設計了1對引物(P1：5′-ATGAAGACCTTCCTCGTCTTT-3′，P2：5′-2 TTATC

AGTAGGCACCAACTCC-3′)[10]。引物由北京奧科生物技術有限公司合成。PCR反應混合物包括12.5 μL×GC buffer，0.2 mmol·L^-1 dNTP，引物各0.5 μmol，1.25 U LA TaqDNA聚合酶(TaKaRa)，50 ng模板DNA，加雙蒸水至總量25 μL。反應條件為94℃預變性5 min，然后94℃變性45 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，反應35個循環，最后72℃延伸10 min。

1.4 目的基因的克隆、測序與序列分析

PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，PCR產物回收純化后到pMD18-T載體(TaKaRa)上，轉化大腸桿菌DH-5α，涂布于含有氨芐青霉素(AMP)的LB培養基上。挑選生長良好的單菌落，用克隆引物進行擴增檢測，PCR反應所用條件與LMW-GS基因編碼區擴增反應相同。將篩選出的不同大小的陽性克隆進行測序，序列測定由北京奧科生物技術有限公司完成。序列分析用NCBI網站的相關軟件和Clustal W。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增、目的基因的回收與T-載體克隆

以ZM11217基因組DNA為模板，用引物

P1/P2進行PCR擴增。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1條大小分別為0.9kb左右的條帶(圖1)。將該條帶回收、純化后，連接到pMD18-T載體上并轉化到大腸桿菌。經菌落PCR鑒定后，獲得1個陽性克隆后進行測序，命名為LMW-ZM11217，對其進行了測序。

2.2 核苷酸與氨基序列分析

LMW-ZM11217完整編碼區長度為870bp，無內含子，編碼288個氨基酸，是一個典型的LMW-GS基因。LMW-ZM11217含有20個氨基酸殘基組成的保守的信號肽，接著是13個氨基酸殘基組成N-末端區，其序列為METSHIPGLEKPL-。N-末端區之后是由83個氨基酸殘基組成的重復區和由172個氨基酸殘基組成的C-末端區。重復區內富含脯氨酸(P)和谷氨酰胺(Q)，含有12個不同類型的可重復短肽(QPLPLQ，QPIQQQP，PPCSQQQQ，PPFSQQQQ等)。LMW-ZM11217的氨基酸序列含有8個半胱酸(C)殘基(圖2)，其中1個位于重復區，另外7個位于C-末端區；與已知的LMW-GS相比，其位置高度保守。

Ikeda等[11]根據已分離的LMW-GS的氨基酸序列和半胱氨酸(C)殘基的相對位置，將LMW-GS分為6類(TypeⅠ-TypeⅣ)。根據LMW-ZM11217所推導的氨基酸序列中半胱氨酸(C)殘基的分布位置，LMW-ZM11217屬TypeⅠ類型。

2.3 氨基序列同源性比較

LMW-ZM11217的氨基酸序列分別與普通小麥的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位點編碼的氨基酸序列進行比較。LMW-ZM11217與Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3 3個位點基因相似性都在62%以上，最高達到83%(表1)。但是由于LMW-ZM11217與Glu-A3和Glu-D3位點基因相似性非常接近(分別為82%和83%)，不能判斷LMW-ZM11217究竟是由Glu-A3和Glu-D3哪個位點控制。

選擇3個位點中與LMW-ZM11217相似性最高的基因序列U86027、AB062852和AB062871進行比較，以顯示其序列特異性(圖2)。根據比較結果LMW-ZM11217與Glu-A3和Glu-D3位點的AB062871、U86027的差異較小，而與Glu-B3位點的AB062852差異最大。LMW-ZM11217與AB062871在信號肽沒有差異，但在N-末端區有3個氨基酸殘基的替換，在重復區有12個氨基酸殘基的替換、26個氨基酸殘基的插入以及7個氨基酸殘基的缺失，在C-末端區有16個氨基酸殘基的替換和2個氨基酸殘基的插入。LMW-ZM11217與U86027在信號肽有1個氨基酸殘基的替換，在N-末端區有4個氨基酸殘基的替換，在重復區有17個氨基酸殘基的替換、2個氨基酸殘基的插入以及21個氨基酸殘基的缺失，在C-末端區有6個氨基酸殘基的替換。LMW-ZM11217與AB062852在編碼區差異同樣也包括氨基酸殘基的替換、插入和缺失，在信號肽有1個氨基酸殘基的替換，在N-末端區有1個氨基酸殘基的替換，在重復區有6個氨基酸殘基的替換、1個氨基酸殘基的插入以及44個氨基酸殘基的缺失，在C-末端區有30個氨基酸殘基的替換。

3 討論

根據等電點和分子量的不同，可將LMW-GS分為B、C和D 3種類型，其中，B和C型亞基的分子量分別為40~50kDa和30~40kDa[12]。而根據LMW-ZM11217推導的氨基酸序列估算的分子量約為32.6kDa。因此，LMW-ZM11217屬于C型亞基。

從湖北地方小麥品種ZM11217中克隆到LMW-GS基因LMW-ZM11217與Cassidy等[5]建立的LMW-GS基因模型一致的序列結構特征，表明具有保守的信號肽、N-末端區、重復區和C-末端區，其中重復區富含谷氨酰胺(Q)和脯氨酸(P)，編碼區內具有8個半胱氨酸殘基(C)。這說明LMW-ZM11217是一個典型的LMW-GS基因，但是由于DNA堿基的替換、插入和缺失其又不同以前報道的LMW-GS基因。與普通小麥的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位點編碼的LMW-GS基因比較結果表明，LMW-ZM11217與Glu-A3和Glu-D3位點控制的基因具有較高的相似性，而與Glu-B3位點控制的基因具有較低的相似性。LMW-ZM11217與Glu-A3和Glu-D3位點控制的基因最高相似性幾乎一致(分別為82%和83%)，故無法判斷其編碼基因的具體位點。

D’Ovidio等[13]認為位于LMW-GS中的第1個和第7個半胱氨酸殘基(C)可形成2個分子間二硫鍵，剩余的6個半胱氨酸殘基(C)形成分子內二硫鍵。根據功能半胱氨酸殘基(C)的位置，Ikeda等[12]將LMW-GS的分為6類，本研究中LMW-ZM11217推導的氨基酸序列屬于TypeⅠ類型。因此我們推測LMW-ZM11217可能與TypeⅠ類型的LMW-GS基因具有相似的品質功能。為了有效改進小麥的營養成分，我們正在構建LMW-ZM11217的胚乳特異性表達載體，進而利用轉基因技術研究其對小麥加工品質的影響。

參考文獻：

[1] GIANIBELLI M C，LARROQUE O R，MACRITICHIE F，et al. Biochemical genetics and molecular characterization of wheat glutenin and its composition subunits [J]. Cereal Chem，2001，78(6)：635-646.

[2] LUO C，GRIFFIN W B，BRANDLARD G，et al. Comparison of low and high molecular weight wheat glutenin allele effects on flour quality [J]. Theor Appl Genet，2001，102：1088-1098.

[3] HE Z H，LIU L，XIA X C，et al. Composition of HMW and LMW glutenin subunits and their effects on dough properties，pan bread，and noodle quality of Chinese bread wheats [J]. Cereal Chem，2005，82：345-350.

[4] NIETO-TALADRIZ M T，PERRETANT M R，ROUSSET M. Effect of gliadins and HMW and LMW subunits of glutenin on dough properties in the F6 recombinant inbred lines from a bread wheat cross [J]. Theor Appl Genet，1994，88：81-88.

[5] CASSIDY B G，DVORAK J，ANDERSON O D. The wheat lowmolecular weight glutenin genes：characterization of six new genes and progress in understanding gene family structure [J]. Theor Appl Genet，1998，96：743-750.

[6] D’OVIDIO R，TANZARELLA O A，PORCEDDU E. Nucleotide sequence of a low-molecular-weight glutenin from Triticum durum [J]. Plant Mol Biol，1992，18：781-784.

[7] 敖立萬.湖北小麥[M].武漢：湖北科學技術出版社，2002.21-23.

[8] LIU Y，XIONG Z Y，HE Y G，et al. Genetic diversity of HMW-GSin Chinese common wheat (Triticum aestivum L.) landraces from Hubei province [J]. Genet Resour Crop Evo，2007，54：865-874.

[9] 汪越勝，覃建兵，汪長東，等.一個小麥低分子量谷蛋白基因的分離[J].武漢植物學研究，2005，23(6)：511-513.

[10] COLOT V，BARTELS D，THOMOPSON C，et al. Molecular characterization of an active wheat LMW glutenin gene and its relation to other wheat and barley prolamin genes [J]. Mol Gen Genet，1989，216(1)：81-90.

[11] IKEDA T M，NAGAMINE T，FUKUOKA H，et al. Identification of new low molecular weight glutenin subunit genes in wheat [J]. Theor Appl Genet，2002，104：680-687.

[12] PANYE P I，CORFIELD K G. Subunit composition of wheat glutenin proteins isolated by gel filtration in a dissociating medium [J]. Planta，1979，145：83-88.

[13] D’OVIDIO R，MARCHITELLI C，CARDELLI LE，et al. Sequence similarity between allelic Glu-B3 genes related to quality properties of durum wheat [J]. Theor Appl Genet，1999，93：455-461.

(責任編輯 昌炎新)