植物抗病基因研究進展

摘要：植物抗病基因在植物抗病過程中起重要作用。綜述了植物抗病基因的克隆方法，結構特點，作用機制以及未來的發展前景。

關鍵詞：R-基因；克隆方法；結構特點；作用機制

中圖分類號：S432.²⁺3；Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2008)05-0598-03

Advance on Plant Resistance Gene Research

SUN Wen-li1，2，3，LIU Yu-hui2，3，WU Yuan-hua1，FU Jun-fan1

(1. Plant Pathology Department，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China；

2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；

3. Important Scientific Engineerings of Gene Resources and Gene Improvement of China＇s Crops，Beijing 100081，China)

Abstract：R gene played an important role in defending the disease. This paper reviewed the gene cloning，structure characteristic，function mechanism and the foreground of R gene.

Key words：R gene，gene cloning，structure characteristic，function mechanism

R基因在植物的病害防御過程中起著非常重要的作用。植物時刻受到周圍各種潛在病原菌的侵染。一旦病原菌侵入植物表皮，將遇到R基因和avr基因的互作，即植物的非寄主抗病性[1]。隨之所產生的現象包括局部細胞壞死(過敏性細胞死亡)，木質素和胼胝質形成，以及所有與抑制病原菌生長和病害發生相關的抗菌物質產生。病原菌還有可能通過不同的途徑賦予植物長期的系統抗性誘導系統免疫，使植物能抵抗其他相似病原菌的侵染[2]。隨著分子生物學的發展，更多的植物抗病基因克隆方法及作用機制逐漸為人們所發現，也有更多的植物抗病基因的功能得到了證實。

1 R基因的克隆方法

1) 表型基因克隆法：利用表現型差異或組織器官特異表達產生的差異來克隆植物基因就是表型克隆。表型克隆在策略上試圖將表型基因與結構基因表達的特征聯系起來，從而分離特定的與表型相關的基因，力求不必事先知道基因的生化功能或圖譜定位，根據基因的表達效應就能直接分離該基因。

2) 轉座子標簽技術：轉座子標簽技術是比較經典的方法，是將轉座子或T-DNA插入到欲分離基因的內部，基因發生突變而被標識，然后利用插入<=6片段做探針克隆到抗病基因。

3) mRNA差異顯示法：是由Peng Liang等人在1992年建立的篩選基因差異表達的有效方法。它是將mRNA逆轉錄技術和PCR技術相結合的一種RNA指紋圖譜技術。具體操作流程如下：組織樣品總RNA的提取→去除RNA樣品中的微量DNA→設計引物序列→逆轉錄歸類反應體系的建立→PCR選擇性擴增→mRNA DD-PCR產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳→差異表達條帶的回收→回收條帶的再次擴增→二次擴增產物的克隆、測序和GenBank查詢→Northern Blot和Dot Blot雜交。

4) 功能克隆：即利用病害已知的遺傳損傷而引起的生化功能如蛋白質氨基酸缺陷的信息進行基因定位，進而克隆該致病基因。

5) 同源序列克隆基因：根據已知的抗病基因設計引物，從相近物種中克隆其同源基因。

6) DNA芯片技術：一種大規模集成的固相雜交，是指在固相支持物上原位合成(in situ synthesis)寡核苷酸或者直接將大量預先制備的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交。通過對雜交信號的檢測分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達的信息)。

7) 圖位克隆法：針對寄主植物與病原菌互作的遺傳模式(即與親和性因子相關的互作模式或與非親和因子相關的互作模式)創造R基因近等基因系(near isogenic line，NIL)及作圖群體材料。由于常用的F2代作圖群體不很穩定，目前發展了以雙二倍群體DHL(double haploid population)、重組自交系RIL(recombinant inbred line)以及回交世代為材料。之后用RAPD和RFLP等方法對R基因進行定位，找到與R基因緊密連鎖的分子標記，并以此作為起始探針，借助“染色體步行(chromosome walking)”或“染色體登陸(chromosome landing)”，在含目的R基因的植物基因組YAC或BAC文庫中篩選分離出目的基因，并通過轉化互補試驗進行驗證。

8)生物信息學的方法用于新基因的發現和鑒定。表達序列標簽EST(expressed sequence tags)是基因表達的短cDNA序列，它們攜帶完整基因某些片段的信息。大多數情況下，EST克隆并不跨越基因的全長區，但有許多生物信息學工具可以幫助獲取某一基因的全長轉錄體信息及其在染色體作圖中的精確定位。近幾年EST數據庫的快速增長，增加了從EST出發尋找新基因的可能，特別是從試驗測得的與功能聯系的新EST發現新基因的可能性更大，通過對已知功能的抗性基因EST序列片段的拼接，以及EST序列和基因組序列的比對，可以尋找新的全長抗性基因[3]。

2 已經克隆得到的R基因及分類

第1個植物抗病基因Hm1是從玉米中分離得到的。Johal和Briggs利用轉座子標簽法首次從玉米中克隆到抗圓斑病基因Hm1。該基因編碼依賴于NADPH的HC毒素還原酶，該酶能降解玉米圓斑病菌(Cochliobolus carbonum)生理小種1所產生的毒素，從而使玉米獲得抗性[4]。據不完全統計，到2006年已克隆的植物抗病基因有51個，其中大部分基因從雙子葉模式植物番茄(Lycopersicum esculent um)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)中獲得。在糧食作物中，人們已克隆到15個抗病基因，其中水稻(Oryza sativa)5個、馬鈴薯(Solanumt uberosum)4個、大麥(Hordeum vulgare)3 個、玉米(Zea mays)₂個和小麥(Triticum aestivum)1 個(表1)[5]。

盡管R基因之間的序列同源性很低，但是這些R基因編碼的蛋白也具有一些相似的結構特征，根據這些結構特征，已經克隆的R基因可以分為5個大類：STK，LRR-TM，NBS-LRR，LRR-TM-STK和Hm1。

1) STK類R基因如番茄Pto基因，其產物是一個沒有LRR結構域，位于細胞質內的典型的絲氨酸-蘇氨酸激酶(Ser-Thrkinase)，通過絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化來傳遞信號[6]。目前已經有證據表明Pto蛋白能與相應無毒基因avrPto的產物相互作用。

2) LRR-TM類R基因的基因產物為錨定于細胞膜上的糖蛋白受體，包括3個區域：LRR結構域，跨膜區域(transmembranedomain，TM)和很短的胞內區域(僅有數十個氨基酸殘基)。信號肽決定了它是胞外輸出的。例如：番茄抗葉霉病不同生理小種的基因Cf-2、Cf-4、Cf-5、Cf-9和Hcr9-4E[7]，以及甜菜抗包囊線蟲的基因Hs1pro-1[8]。

3) NBS-LRR類R基因的共同特點：在它們編碼蛋白的近N端處存在著核苷酸結合位點(nucleotidebindingsite，NBS)。而在它們的近C端則存在著富含亮氨酸的重復序列(leucine-richrepeat，LRR)。LRR是蛋白與蛋白相互作用的一種典型結構，它是由十多個β折疊-環-α螺旋基本單位串聯形成的空間構型，呈蹄鐵(horseshoe)狀的結構。這些膜受體的LRR結構伸展于細胞外，蹄鐵狀結構的凹陷處便是結合多樣性配體的部位。該類R基因又可分成3個亞類，即LZ-NBS-LRR亞類，如RPS2、PRS5、RPP8、RPP13、RPM1、Rx2、Prf、Mi基因；TIR-NBS-LRR亞類，如RPS4、RPP5、N、L6、L11、M基因；NBS-LRR亞類，如I2、Xa1、Pib、Bs2、Cre3基因。

4) LRR-TM-STK類R基因，如水稻抗白葉枯病基因Xa21編碼的蛋白是一類受體蛋白激酶[9]，它既含有與Cf-9蛋白相似的胞外LRR受體結構域，又含有與Pto蛋白相似的胞內PK結構域，在這兩個區域之間存在一個跨膜區。

5) Hm1類R基因為玉米抗HC-毒素基因Hm1。玉米圓斑病菌(C.carbonum)1號小種產生HC-毒素，它是一個環狀的四肽。當玉米在位點Hm1隱性純合時，該四肽是有毒致命的。研究發現顯性的Hm1編碼HC-毒素還原酶(HCTR)，它依賴于NADPH。雖然Hm1被認為是第1個被克隆的小種專化性抗病基因，但它不是真正的抗病基因，因為它的抗病作用并沒有一系列的信號傳導，HC-毒素合成也不止1個基因[10]。該基因的克隆不僅對玉米圓斑病的防治有重大意義，且對植物抗病基因研究，尤其抗毒素研究具有重大意義。

3 R基因的作用機制

多年研究結果表明，誘導防衛反應是由植物特異抗病基因介導完成的[11]。從目前來看，其至少有5類不同的作用機制。

1)抗病基因編碼產物能鈍化病原菌侵染時產生的毒素，進而抑制病原菌的繁殖。如Johal和Briggs克隆的世界上第1個植物抗病基因Hm1[10]。該基因能編碼依賴于NADPH的HC毒素還原酶，該酶能使玉米圓斑病菌生理小種1所產生的毒素失活，從而使玉米獲得抗性。

2) 顯性基因能編碼病原菌致病性的靶標物。若植物缺乏該靶標物就會產生抗性。如玉米線粒體基因T-urfl3，該基因不僅能編碼與雄性不育有關的蛋白，也能編碼與病原菌(Bipolaris maydis)生理小種T分泌毒素親和的產物，導致玉米與病原菌發生親和性互作，即植株感病。而缺乏該基因的玉米品種則抗該種病原物[12]。最近，Vogel等在擬南芥抗白粉病研究中也發現類似的機制[13]。

3) 抗病基因表達產物直接引發抗病反應。到目前為止，只在大麥中發現這種作用機制。研究發現，大麥顯性基因Mlo編碼由534個氨基酸殘基組成的分子量為60 kDa含7個跨膜域的膜錨定蛋白，它可能是植物細胞死亡和其他防衛系統的負調控因子，而含隱性基因mlo的植株則能抵抗病原菌(Erysiphe graminis f. sp. hordei)的侵染[14]。

4)植物抗性基因表達產物能特異性識別病原菌中相應無毒基因編碼的產物，并產生信號分子，這些信號分子經信號傳遞因子傳遞后，開啟植物防衛基因的表達，最終對病原菌產生抗性。如蛋白磷酸化、Ca++濃度變化、活性氧變化、水楊酸變化和離子流等[15]。植物防衛基因的表達主要包括谷胱甘肽S轉移酶、過氧化物酶、細胞壁蛋白、蛋白酶抑制劑、水解酶(如幾丁質酶和1，3-b葡聚糖等)及涉及次級代謝的病程相關(pathogenesis-related，PR)蛋白和酶等[16]。

5)編碼植物新陳代謝相關酶的基因在植物病害防治中起關鍵性作用。越來越多的實驗證據表明，植物新陳代謝中某些酶的組成型表達，在植物的抗病性中起關鍵性作用[17]，例如，調控S-腺苷甲硫氨酸甲基化代謝循環的關鍵酶植物腺苷激酶(adenosin kinase)在植物抗病毒抗性中起作用[18]；調節植物C新陳代謝的SNF1激酶與植物抗病毒抗性相關[19]。擬南芥NHO1(nonhost，NHO1)基因編碼一種甘油激酶，植物對丁香假單胞菌非毒性小種的抗性互作需要NHO1的參與，而丁香假單胞菌的毒性小種通過茉莉酸信號途徑，強烈抑制植物NHO1基因的表達[20]。Taler等認為，野生香瓜過氧化物體中乙醛酸氨基轉移酶的表達，保護植物使之免受霜霉病菌的侵害，是植物另一種形式的“酶學抗病性”(enzymatic disease resistance)[21]。

4 R基因在植物抗病中的應用及展望

植物抗病基因的發現已使得多種植物病害得到了成功防治。例如水稻白葉枯病、番茄葉霉病、甜瓜霜霉病等等。隨著分子生物學，植物抗病基因工程的發展，R基因的克隆方法已越來越多，必將有更多的抗病基因為人們所發現。這也將為利用傳統育種方法或轉基因手段培育抗病品種提供更多的基因資源。

參考文獻：

[1] DANGL J，JONES J D G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection [J]. Nature，2001，411，826-833.

[2] FEYS B J，PARKER J E. Interplay of signaling pathways in plant disease resistance[J]. Trends Genet. 2000，16，449-455. [3] HATTORI J，OUELLET T，TINKER N A. Wheat EST sequence assembly facilitates comparison of gene content s among plant species and discovery of novel genes[J].Genome，2005，48 (2)：197-206.

[4] JOHAL G S，BRIGGS S P.Reductase activity encoded by the HM1 disease resistance gene in maize[J]. Science，1992，258：985-987.

[5] 王忠華，賈育林，夏英武. 植物抗病分子機制研究進展[J].植物學通報，2004，21 (5)：521-530.

[6] MARTIN G B，WILLIAMS J G K，Tanksly S D. Rapid identification of markers linked to a pseudomonas resistance gene in tomato by using random primers and near-isogenic lines[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1991，88：2336-2340.

[7] JOOSTEN MHAJ，DE WIT PJGM. The tomato Cladosporium fulvum interaction：a versatile experimental system to study plant-patogen interactions[J]. Annu Rev Phytopathol，1999，37：335-379.

[8] CAID G，KLENE M，KIFLE S，et al. Positional cloning of a gene for nematode resistance in sugar beet[J]. Science，1997，275：832-834.

[9] SONG W Y，WANG G L，CHEN L L，et al. A receptor kinase-likeprotein encoded by rice disease resistance gene，Xa21[J]. Science，1995，270：1804-1806

[10] JOHAL G S，BRIGGS S P.Reductase activity by the HM1 disease resistance gene in maize[J].Science，1992.258：985-987.

[11] DANGL J L，JONES J D G. Plant pathogens and integrated defense responses to infection[J].Nature，2001，411：826-833.

[12] BRAUN C J，SIEDOW J N，WILLIAMS M E，et al.Mutations in the maize mitochondrial T-urfl3 gene eliminate sensitivity to a fungal pathotoxin[J].Proc Natl Acad Sci USA，1989，86：4435-4439.

[13] VOGEL J，SOMERVILLE S，VOGEL P，et al. Isolation and characterization of powdery mildew-resistant Arabidopsis mutants[J]. Proc Natl Acad Sci，2000，97：1897-1902.

[14] BFISCHGES R，HOLLRICHER K，PANSTRUGA R，et al. The barley Mlo gene：a novel control element of plant pathogens resistance[J]. Cell，1997.88：695-705

[15] XICAI YANG，YIN YIE，FENG ZHU，et al. Ribozyme-mediated high resistance against potato spindle tuber viroid in transgenic potatoes[J].Proc Natl Acad Sci USA. 1997，94：4861-4865.

[16] BAOLONG ZHU，TONY H H CHEN，PAUL H LI. Analysis of Late-blight disease resistance and freezing tolerance in transgenic potato plants expressing sense and antisense genes for osmotin-like protein[J]. Planta，1996，198(1)：70-75.

[17] ECKARDT N A. Aminotransferases confer ‘enzymatic resistance’ to downy mildew in melon[J]. The Plant Cell ，2004，16(1)：1-3.

[18] WANG H，HAO L，SHUNG C Y，et al. Adenosine kinase is inactivated by geminivirus AL2 and L2 proteins[J].Plant Cell，2003，15：3020-3032.

[19] HAO L，WANG H，SUNTER G，et al. Geminivirus AL2 and L2 proteins interact with and inactivate SNF1 kinase[J]. Plant Cell，2003，15：1034-1048.

[20] KANG L，LI J，ZHAO T，et al. Interplay of the Arabidopsis nonhost resistance gene NHO1 with bacterial virulence[J].Proc Natl Acad Sci USA.2003，100：3519-3524. [21] TALER D，GALPERIN M，BENJAMIN I. Plant eR genes that encode photorespiratory enzymes confer resistance against disease[J]. Plant Cell，2004，16：172-184.

(責任編輯 昌炎新)