奶牛乳房炎相關功能基因組學與蛋白質組學研究進展

摘要：功能基因組學與蛋白質組學是在基因組和蛋白質整體水平上分析基因功能，研究技術包括差異顯示反轉錄PCR、表達序列標簽、基因表達系列分析、生物芯片、RNA干涉、生物信息學、二維凝膠電泳(2-DE)、質譜(MS)等。綜述了功能基因組學和蛋白質組學及其研究技術在奶牛乳房炎相關的基因表達、抗性候選基因鑒定、病原微生物蛋白質組學、基因治療、新診斷靶標篩選等的應用研究進展及展望。

關鍵詞：奶牛；乳房炎；功能基因組學；蛋白質組學；基因表達

中圖分類號：S823.9+1；Q78：Q815 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2008)05-0601-05

Progress on Mastitis-Related Functional Genomics And Proteomics in Dairy Cows

CAO Sui-zhong1，2，YAO Xue-ping1，ZHAO Xing-xu2，DU Li-xin3

(1.College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，Sichuan，China；

2.College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；

3.Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100094，China)

Abstract：Functional genomics and proteomics were systemically and comprehensively analyzed the function of genes at the level of the whole-genome and proteins. The main research techniques for functional genomics and proteomics include included differential display reverse transcription-PCR(DDRT-PCR)，expressed sequence tag，serial analysis of gene expression，biochip，RNA interference，two-dimensional gel electophoresis(2-DE)，mass spectrometry (MS) and bioinformatics. This paper reviewed current research progress on mastitis-related functional genomics and proteomics，which included mastitis-related gene expression，identification of candidate genes for mastitis resistance，proteomics of bacterial pathogens，gene therapy，treatment and diagnosis biomarkers for mastitis. Furthermore，took a view of functional genomics and proteomics prospect to study of mastitis in dairy cows.

Key words：dairy cows；mastitis；functional genomics；proteomics；gene expression

乳房炎是當今造成世界各國奶牛業損失最嚴重的疾病之一。以前對控制奶牛乳房炎易感性的基礎生理因素、分子機制和基因系統了解很少，嚴重阻礙了人們通過治療、免疫接種和遺傳選擇等途徑提高奶牛對乳房炎的整體抗病力[1]。為徹底解決奶牛乳房炎這一困擾奶牛業的難題，世界各國均對奶牛乳房炎進行了大量的相關研究。近年來，隨著功能基因組學和蛋白質組學的發展，為研究解決奶牛乳房炎這一長期困擾奶牛業的世界性難題提供了新的方向及有力工具[2]。目前，功能基因組學和蛋白質組學研究方法與技術已被廣泛地應用于奶牛乳房炎相關研究，并取得了許多重要進展，本文對此進行了綜述。

1 概述

1.1 功能基因組學

隨著人類基因組計劃(HGP)的提前完成和美國國家人類基因組研究所今后工作目標的公布，以功能基因鑒定為中心的功能基因組學(Functuional Genomics)成為基因組研究的重心[3]。功能基因組學主要是在基因組或系統水平上全面分析基因的功能，使得生命科學研究從對單一基因或蛋白質的研究轉向對多個基因或蛋白質同時進行系統的研究。它以高通量、大規模實驗方法及統計與計算機分析為特征，研究內容包括基因功能發現、基因表達分析、基因表達調控及突變檢測等[4]。

功能基因組學主要研究技術包括差異顯示反轉錄PCR、抑制性消減雜交、表達序列標簽、基因表達系列分析、生物芯片、RNA干涉、反向遺傳學和生物信息學等。

1.2 蛋白質組學

1994年，澳大利亞Macquarie大學的Wilkins和Williams首次提出了蛋白質組(Proteome)概念，它指一個基因組或一個細胞、組織表達的所有蛋白質。蛋白質組學(Proteomics)則是以全面的蛋白質性質研究(如表達水平、轉錄后修飾、細胞內定位、相互作用等)為基礎，在蛋白質整體水平對疾病機理、細胞模式、功能聯系等方面進行探索的科學。2001年Abbott在《Nature》撰文指出，蛋白質是理解細胞功能和疾病過程的核心，如果沒有蛋白質組學方面的共同努力，基因組學研究的成果就不能實現[5]。因此，在蛋白質組學誕生后的短短數年時間內，蛋白質組學迅速發展成為當今生命科學研究的前沿領域，并取得了一系列巨大的成就，特別是2003年3月《Nature》第6928期有關蛋白質組學的系列綜述文章的發表更是將蛋白質組學研究推上了一個新的發展高潮[6-9]。

蛋白質組學的誕生提供了一套在整體蛋白質水平大規模研究基因功能的有力工具[7-9]。二維凝膠電泳(2-DE)技術、計算機圖像分析與大規模數據處理技術以及質譜(MS)技術被稱為蛋白質組研究的三大基本支撐技術，此外熒光雙向差示凝膠電泳(2-D DIGE)、酵母雙雜交、噬菌體展示、蛋白質芯片等蛋白質組研究的新技術也不斷出現。

2 奶牛乳房炎相關的功能基因組學研究

2.1 奶牛乳腺組織及血液白細胞EST的產生

美國密西根州立大學動物功能基因組學中心Yao等[10]從4頭健康泌乳中期荷斯坦奶牛外周血樣中提取總白細胞mRNA構建了均一化?？偘准毎鹀DNA文庫，從中產生了842條非冗余cDNA序列。

Sonstegard等[11]選擇18頭不同年齡階段的健康或實驗性乳房炎荷斯坦奶牛，采集乳腺組織、提取mRNA組成總mRNA池，然后構建了均一化cDNA文庫(normalized cDNA library)，從中產生的23 202條EST序列已提交GenBank dbEST。

2.2 乳房炎相關的基因譜研究

Madsen等[12]采用微陣列技術分析研究了分娩期奶牛外周血多形核白細胞基因表達譜的變化，結果顯示牛總白細胞(bovine total leukotyte)中302個基因的表達受到分娩的影響，而其中最大的一部分是編碼調控細胞凋亡蛋白的基因。Preisler等[13，14]研究了圍產期荷斯坦奶牛外周血單核細胞及多形核白細胞中糖皮質激素受體(Glucocorticoid receptors，GRs)基因表達變化，結果表明在奶牛分娩時隨著腎上腺可的松分泌的增加，GRs的表達下調，而GRs的表達下調與分娩時單核細胞、多形核白細胞的功能障礙有關，由此也可以解釋圍產期奶牛易感乳房炎的部分原因。

多形核嗜中性白細胞(Polymorphonuclear neutrophil leukocyte，PMN)表達許多細胞表面受體，如趨化受體、CD14、黏附受體及調理素受體等，它們能增強PMN對進入乳腺病原的抵抗力[2]。Nishimura[15]指出大鼠乳腺細胞表達糖基化依賴的細胞黏附分子-1(GlyCAM-1)、黏膜地址素細胞黏附分子-1(MadCAM-1)及IL-8、GRO-α、MCP-1等趨化因子，促使炎癥時白細胞向乳腺中遷移。一些研究結果還表明奶牛乳腺感染時，奶牛乳腺組織中熱休克蛋白如HSP89α、HSP89β、HSP70、HSP60、HSP₂0和參與組織修復與恢復的細胞因子aFGF、bFGF、EGF、TGF-α、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ等[16]及抗菌活性物質乳鐵蛋白(lactoferrin，Lf)[17]的表達量增加。

Tao等[18]選擇167個與免疫、內分泌和炎癥應答基因相關的cDNA序列構建了一個牛免疫-內分泌cDNA微陣列，研究感染、免疫接種或疾病等生理或環境應激條件下奶牛免疫-內分泌軸基因的差異表達，結果發現在伴刀豆凝集素A(ConA)刺激6h和24 h后，單核細胞產生的細胞因子和趨化因子(IL-2、IL-1α、TNFα、IFN-γ、TGFβ-1、MCP-1、MCP-2與MCP-3α)的表達上調了至少2倍，而相反抗原呈遞分子(MHC-DR、MHC-DQ與MHC-DY)的表達則下調了2倍。

Burton等[19]應用免疫學微陣列和實時RT-PCR技術研究腎上腺皮質激素對奶牛血液中嗜中性粒細胞功能的影響，發現在給予激素治療和分娩期間腎上腺皮質激素對嗜中性粒細胞的發育、壽命和組織防御功能發揮著關鍵的調控作用，在此期間腎上腺皮質激素可上調IKB KINASE ALPHA，JUN-D PROTO-ONCOGENE等基因和下調CD164、GRO-Beta、BAX-ALPHA等基因的表達，這些基因編碼的蛋白調控細胞凋亡、趨化及黏附等。

2.3 奶牛乳房炎抗性相關基因的篩選

基因的差異表達不僅是細胞形態和功能多樣性的根本原因，而且也是生理及病理過程的物質基礎。奶牛在乳房炎抗性方面的差異本質上是通過各種基因在特定的時間和空間選擇性表達而實現的。白細胞在奶牛乳腺免疫中發揮著關鍵作用[20]，通過對非圍產期和圍產期奶牛白細胞功能的體內外對比研究提供了圍產期奶牛全身及乳房局部免疫防御缺陷的充足證據，并由此推斷出圍產期奶牛乳房炎的高發生率可能是由免疫缺陷導致的結果。Burton等[21]還指出，在圍產期體內外測定的免疫應答性狀通常比乳房炎本身有較高的遺傳力，表明圍產期奶牛免疫力水平可能是鑒定乳房炎抗性基因的關鍵。因此，Yao等[10，21-23]聯合應用DDRT-PCR、cDNA微陣列及生物信息學等功能基因組學研究技術，對圍產期及其圍產期前后奶牛外周血白細胞mRNA水平整體基因表達的變化進行了系統地研究，發現了超過25個以上可能與奶?？剐韵嚓P的候選基因，而其中絕大多數基因與血液白細胞正常的生長、代謝和免疫監視功能有關。

Schwerin等[24]應用DDRT-PCR技術研究了健康和患臨床型乳房炎奶牛乳腺組織中基因的差異表達，鑒定出AHCY(the S-adenosylhomocysteine hydrolase encoding gene)、PRKDC(the DNA-dependent protein kinase)、HNRPU(the scaffold attachment factor A)、OSTF1(osteoclast stimulating factor 1)等4個可能與乳房炎抗性相關的候選基因并進行了基因定位。

2.4 基因治療

通過轉基因技術等使一些抗菌蛋白在奶牛乳腺細胞中高表達能提高奶牛對乳房炎的抗性[25]。溶葡萄球菌素(Lysostaphin)是由模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)分泌的一種肽聚糖水解酶，乳中極低的濃度即具有抗葡萄球菌的活性，Kerr等通過轉基因技術使溶葡萄球菌素基因在乳腺中定向表達達到了抗乳房炎的目的[26]。孫懷昌等人也將兩種自行構建的表達人溶菌酶基因(hLYZ)的重組質粒pTLYZ和p205C₃LYZ注射到感染乳房炎奶牛的乳腺，經加州乳房炎試驗(CMT)試驗證明重組質粒pTLYZ和p205C₃LYZ對臨床型和隱性乳房炎具有可靠、持久的治療效果[27]。

3 奶牛乳房炎相關的蛋白質組學研究

近年來，盡管與奶牛乳房炎相關的功能基因組學研究取得了一系列重要的進展，但是目前尚未闡明影響奶牛乳房炎抗性等方面的分子機理，而蛋白質組學研究的發展將為奶牛乳房炎相關研究帶來新的發現。

迄今為止，國際上應用蛋白質組學研究奶牛乳房炎的報道還非常有限，而國內應用蛋白質組學技術研究奶牛乳房炎的工作剛剛起步，但是蛋白質組學在奶牛乳房炎相關研究中的重要性已經引起Paape等一些國際上從事奶牛乳房炎相關研究的權威專家高度重視[2，28]。

3.1 奶牛乳房炎相關的蛋白質表達譜研究

奶牛多形核嗜中性白細胞(PMN)在奶牛乳腺免疫中發揮著非常重要的作用[2]。Lippolis和Reinhardt[28]應用一維電泳-反向高效液相色譜-電噴霧串聯質譜技術對奶牛PMN蛋白質組進行了研究，共鑒定出250個蛋白，其中包括了一些與PMN細胞信號轉導、凋亡、吞噬、活動性、抗菌及其他與PMN免疫功能有關的蛋白，這對我們深入的理解奶牛PMN的生物學功能提供了一個全景蛋白圖譜。

Hogarth等[29]用雙向凝膠電泳(2-DE)與基質輔助激光解析電離質譜(MALDI-MS)技術研究了患臨床乳房炎奶牛和健康奶牛的乳清蛋白質組，結果顯示：在奶牛發生臨床乳房炎期間乳清中轉鐵蛋白和白蛋白含量升高，而α-乳清蛋白和β-乳球蛋白含量降低。Smolenski等[30]應用2-DE、MALDI-MS等研究技術發現患乳房炎奶牛乳汁微量蛋白中至少有15種參與奶牛乳腺對感染的防御，其中包括血清淀粉樣蛋白A、鈣粒蛋白C、乳酸過氧化物酶等。

目前，荷斯坦奶牛肝臟、腎臟、肌肉、血漿、紅細胞等組織和體液的2-DE參考圖譜等蛋白質組數據庫已經建立，并在國際互聯網上公布(http：//iabbam.na.cnr.it/Biochem)[31]，極大的方便了對奶牛乳房炎抗性相關的蛋白質組學進行深入研究。

3.2 奶牛乳房炎診斷新靶標研究

奶牛血清或乳汁中結合珠蛋白(haptoglobin，Hp)、血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A，SAA)和α1-酸性糖蛋白(alpha1 acid glycoprotein，AAG)等一些急性時相蛋白(acute phase proteins)[32]和MMP-2與MMP-9等基質金屬蛋白酶[33]在乳房炎早期診斷中具有重要價值。目前，針對奶牛乳汁中乳清蛋白的2-DE分析技術已經成功地建立[34，35]，而血清蛋白質組學研究技術也已日趨成熟。Baeker等[35]采用2-DE 和MALDI-TOF-MS、反向高效液相色譜(reversed phase-high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)技術研究發現奶牛乳汁中Lipocalin型前列腺素D 合成酶(Lipocalin-type prostaglandin D synthase)可以作為乳房炎早期診斷的一個新靶標(biomarker)。

3.3 奶牛乳房炎致病微生物蛋白質組學研究

病原微生物蛋白質組學(Proteomics of microbial pathogens)研究為鑒定病原微生物病原決定簇和免疫原性蛋白、理解它們的致病性和耐藥性機制、發展新的診斷靶標和研制疫苗提供了新的有力工具[36，37]。例如，Taverna等[38]建立了奶牛乳房炎病原金黃色葡萄球菌細胞表面可溶性蛋白2-DE參考圖譜，為將來比較金黃色葡萄球菌不同菌株對奶牛的致病性和通過血清蛋白質組分析鑒定疫苗候選抗原奠定了重要基礎。

4 展望

功能基因組學與蛋白質組學的誕生和發展提供了一批以大規模與高通量為特征的基因組整體水平和蛋白質整體水平上研究基因功能的新技術、新方向。乳房炎是造成當今世界奶牛業損失最大的復雜疾病，功能基因組學與蛋白質組學對研究：①乳房炎相關基因的差異表達；②乳房炎抗性相關基因的識別、鑒定和克??；③乳房炎抗性相關基因的結構與功能；④與乳房炎防治相關基因的表達調控；⑤乳房炎主要病原微生物的致病性、耐藥機制及高效疫苗研制；⑥發現奶牛乳房炎診斷、療效評價新靶標等重大問題提供了非常有力的工具。通過對乳房炎相關的功能基因組學與蛋白質組學研究，可以闡明奶牛乳房炎易感性或抗性以及乳房炎病原菌致病性的分子機制，從而可以發展新的乳房炎診斷和治療方法、生產新的高效疫苗以及選擇準確、直觀的分子遺傳標記用于標記輔助選擇(marker assisted selection，MAS)，共同提高奶牛對乳房炎的整體抗病力，從而大大降低奶牛乳房炎的發生率。

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(責任編輯 昌炎新)