結(jié)構(gòu)域Ｔｔ ＡＰｕＸ２１基因的分離與克隆研究

摘要：以熱產(chǎn)硫化氫高溫厭氧桿菌菌液為模板，根據(jù)Gene Bank中登記的編碼結(jié)構(gòu)域Tt APuX21基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，利用多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)，擴(kuò)增出目的基因Tt apux21，并克隆到表達(dá)載體pET21a(+)中。經(jīng)菌液PCR篩選和DNA測(cè)序鑒定，表達(dá)載體pET21a(+)中插入有序列正確的Tt apux21基因，重組質(zhì)粒命名為pEX21。

關(guān)鍵詞：結(jié)構(gòu)域；PCR擴(kuò)增；克隆

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114(2008)05-0493-03

Study on Isolation and Cloning of the Gene Encoding Module Tt APuX21

XIE Wan-bin

(College of Chemistry and Bioengineering，Yichun University，Yichun 336000，Jiangxi，China)

Abstract：A pair of specific primers were designed according to the gene sequence encoding module Tt APuX21 adopted in Gene Bank. By the improved PCR amplification technology，interest gene Tt apux21 was obtained from Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus，and then cloned into expression vector pET21a(+). Bacterial culture PCR showed that interest gene Tt apux21 had been inserted into pET21a(+)，and DNA sequencing revealed that the sequence of the inserted fragment was the same as that of Tt apux21 adopted in Gene Bank (accession number：M28471). The recombinant plasmid was designated as pEX21.

Key words：module；PCR amplification；cloning

能源短缺已成為世界范圍內(nèi)普遍存在的問(wèn)題，且隨著石油、天然氣等不可再生能源的消耗速度加快，能源短缺問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重。生物質(zhì)能作為一種替代能源，資源豐富，具有廣闊的前景。碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active enZYmes，CAZY)可將秸稈大分子纖維素等降解為葡萄糖[1-3]，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為乙醇，制成乙醇燃料，成為解決能源短缺問(wèn)題的一種可行途徑。然而，天然的碳水化合物活性酶將秸稈大分子纖維素等降解為葡萄糖的活性不高。碳水化合物活性酶分子由催化結(jié)構(gòu)域(Catalytic Module)和非催化的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Carbohydrate Binding Module，CBM)組成，CBM對(duì)碳水化合物活性酶催化活性的發(fā)揮起著很重要的協(xié)同作用。CBM可以提高碳水化合物活性酶的催化活性。去除酶分子中的CBM顯著降低酶分子的活性，特別是當(dāng)?shù)孜餅椴蝗苄远嗵菚r(shí)，去除CBM后碳水化合物活性酶的活性下降更快。而通過(guò)基因操作將CBM與無(wú)CBM的碳水化合物活性酶連接在一起則可以顯著提高酶活性。這是因?yàn)镃BM可以從兩個(gè)方面影響酶活性：①CBM可以直接作用于大分子纖維素等，使這些大分子的物理結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可以提高酶分子的催化結(jié)構(gòu)域的作用能力；②CBM可以將酶分子與其底物的距離拉近，并保持酶分子與底物的結(jié)合狀態(tài)，從而增加了酶分子作用底物的機(jī)會(huì)[4]。

至今，已報(bào)道碳水化合物活性酶中存在49個(gè)家族的CBM，每個(gè)家族至少有1個(gè)成員的功能已研究清楚，被證明這些CBM都能夠與碳水化合物相互作用，從而提高碳水化合物活性酶的催化活性。不同家族CBM的配基特異性(Ligand Specificity)和結(jié)合能力(Binding Capacity)各異[4]。但是，每個(gè)家族的CBM通常只是對(duì)一種多糖有顯著作用，而能夠結(jié)合多種多糖并能提高酶活性的CBM還需進(jìn)一步研究。近來(lái)報(bào)道的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的CBM新家族X(qián)21和X25等，含有這些新CBM的碳水化合物活性酶與秸稈內(nèi)多種多糖的降解有關(guān)。因此，弄清楚這些未知功能CBM的配基特異性對(duì)于了解植物細(xì)胞壁復(fù)雜糖類(lèi)的降解、生產(chǎn)高效的秸稈降解用碳水化合物活性酶具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

Tt APuX21是CBM新家族X(qián)21的一個(gè)成員，由129個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，是熱產(chǎn)硫化氫高溫厭氧桿菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)的直鏈淀粉-普魯蘭糖酶(Amylase-Pullulanase)中的1個(gè)未知功能結(jié)構(gòu)域。本研究將利用現(xiàn)有的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)Tt APuX21進(jìn)行克隆表達(dá)，通過(guò)多糖微陣技術(shù)(Polysaccharide Microarray)和非變性親和電泳(Non-Denaturing Affinity Electrophoresis，NDAE)篩選其配基，以期發(fā)現(xiàn)具有新的配基特異性的新CBM，用來(lái)提高碳水化合物活性酶降解秸稈的活性，將秸稈大分子纖維素等高效地降解為葡萄糖，促進(jìn)纖維素→葡萄糖→乙醇的轉(zhuǎn)化途徑的順利實(shí)現(xiàn)。目前已將編碼結(jié)構(gòu)域Tt APuX21的基因分離出來(lái)，并克隆到表達(dá)載體pET21a(+)中，結(jié)構(gòu)域Tt APuX21的誘導(dǎo)表達(dá)和功能分析正在進(jìn)行中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、大腸桿菌Tuner、熱產(chǎn)硫化氫高溫厭氧桿菌和質(zhì)粒pET21a(+)均由英國(guó)紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)(University of Newcastle)Harry J. Gilbert教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 Ex Taq HS DNA聚合酶、DNA Marker、限制性?xún)?nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ和T4 DNA 連接酶購(gòu)自大連寶生物公司；DNA快速純化/回收試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)公司。

1.1.3 引物 根據(jù)編碼結(jié)構(gòu)域Tt APuX21的基因Tt apux21，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物。

上游引物(Pf)為：5′ CCGCATATGGGACCTGATAATAAC 3′，下劃線(xiàn)部分為NdeⅠ位點(diǎn)；

下游引物(Pr)為：5′ CACCTCGAGAGTAAGTT

CGAAGTC 3′，下劃線(xiàn)部分為XhoⅠ位點(diǎn)。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Tt apux21的PCR擴(kuò)增 以熱產(chǎn)硫化氫高溫厭氧桿菌菌液為模板，用Ex Taq HS DNA polymerase對(duì)Tt apux21進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：Pf(20 μmol·L^-1) 0.5 μL；Pr (20 μmol·L^-1) 0.5 μL；菌液0.2μL；10×PCR reaction buffer 2 μL；dNTP mixture(各2.5mmol·L^-1) 2μL；ddH2O 14.7 μL；Ex TaqDNA polymerase 0.1 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性300s[5]；然后94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸300 s。PCR產(chǎn)物做1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。

1.2.2 Tt apux21的克隆 用NdeⅠ和XhoⅠ分別雙酶切PCR產(chǎn)物及pET21a(+)表達(dá)載體，然后進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化進(jìn)克隆宿主菌大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，具體操作方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

1.2.3 陽(yáng)性克隆的篩選 從轉(zhuǎn)化平板上挑單菌落，接種于5mL含Amp50 μg·mL-1的 LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)12 h左右。取1 μL上述培養(yǎng)液，做100×稀釋?zhuān)瞥删耗０澹?.2.1款做菌液PCR。PCR產(chǎn)物做1%瓊脂糖凝膠電泳，若結(jié)果顯示有與Tt apux21大小一致的PCR產(chǎn)物，則可初步推斷該單菌落為陽(yáng)性克隆。

1.2.4 陽(yáng)性克隆的測(cè)序鑒定 取經(jīng)菌液PCR篩選到的陽(yáng)性克隆培養(yǎng)液850 μL、滅菌甘油150 μL，置于1.5 mL離心管中，混勻，送上海英駿生物技術(shù)有限公司，用通用引物T7 promoter primer對(duì)插入片段進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Tuner 經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序鑒定正確后，將陽(yáng)性克隆中的重組質(zhì)粒命名為pEX21，并將pEX21轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)宿主菌大腸桿菌Tuner感受態(tài)細(xì)胞中，以便進(jìn)行后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)和功能分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 Tt apux21的PCR擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示：在250bp～500bp之間有一明顯擴(kuò)增片段(圖1)，與預(yù)期的片段大小一致(根據(jù)引物的設(shè)計(jì)，預(yù)期的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為405bp)。

2.2 陽(yáng)性克隆的篩選

分別將Tt apux21與pET21a(+)的連接產(chǎn)物和空質(zhì)粒pET21a(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單菌落進(jìn)行LB液體培養(yǎng)，然后做菌液PCR，結(jié)果顯示：連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化菌在250bp～500bp之間有一明顯擴(kuò)增片段，與Tt apux21大小一致(圖2第1泳道)，而空質(zhì)粒pET21a(+)的轉(zhuǎn)化菌無(wú)此特異片段(圖2第2泳道，在此作為陰性對(duì)照)。

2.3 陽(yáng)性克隆的測(cè)序鑒定

取經(jīng)菌液PCR篩選到的陽(yáng)性克隆培養(yǎng)液，送上海英駿生物技術(shù)有限公司，用通用引物T7 promoter primer對(duì)插入片段進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定，將測(cè)序結(jié)果(圖3)與Gene Bank中熱產(chǎn)硫化氫高溫厭氧桿菌(熱產(chǎn)硫化氫梭菌)的直鏈淀粉-普魯蘭糖酶基因的x21序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析。結(jié)果表明，所得的陽(yáng)性克隆為載體pET21a(+)中插入有序列正確的Tt apux21片段，克隆成功。

參考文獻(xiàn)：

[1] HAZLEWOOD G P，GILBERT H J.Structure and function analysis of Pseudomonas plant cell wall hydrolases[J]. Prog Nucl Acid Res Mol Biol，1998，61：211-241.

[2] TOMME P，WARREN R A J，GILKES N R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi[J]. Adv Microb Physiol，1995，3：71-81.

[3] WARREN R A J.Microbial hydrolysis of polysaccharides[J]. Ann Rev Microbiol，1996，50：183-212.

[4] HENRISSAT B. CAZy website：http：//afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/fam/acc_CBM.html. 2008.

[5] 生秀杰，周偉強(qiáng)，姜 莉，等.應(yīng)用以菌落為模板的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)篩選重組陽(yáng)性克隆[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2002，25(4)：239-240.

[6] J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

(責(zé)任編輯 昌炎新)