甘蔗ＤＮＡ導入玉米自交系性狀變異的研究

摘要：采用花粉管通道法將甘蔗DNA導入普通玉米自交系，獲得了變異植株，從中選出優良變異株，經3代自交觀察，在D₃代各農藝性狀趨于穩定。對其主要農藝性狀進行方差分析和D₃代植株的葉綠素含量等生理生化分析，從中選出優良株系20-500①和20-500②，其葉綠素、可溶性糖、蛋白質含量均比對照提高，可為今后玉米雜交育種提供中間材料。

關鍵詞：花粉管通道法；甘蔗DNA；變異植株；農藝性狀

中圖分類號：S513；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2008)05-0498-03

Study on Traits Variation of Inbred Line of Corn Inducted from Sugarcane DNA

ZHANG Hui-ying1，LIU Ai-hua2，XUE Yan-xia2

(1. Agronomy College of Guangxi University，Nanning 530005，China；

2. Agriculture Vocational and Technical College of Guangxi，Nanning 530007，China)

Abstract：Through pollen-tube-pathway method，sugarcane of total DNA was successfully introduced into the inbred generation of common corn and variant plants were obtained. After three generations observing，The traits of D₃ generation become stable and the best strains were selected from them. After analyzing photosynthetic pigment contents and quality characteristics of the strain，good plants 20-500①and 20-500②were found，They could become middle materials of corn breeding in the future.

Key words：pollen-tube-pathway method；sugarcane DNA；variant plants；agronomy trait

早在1974年，周光宇在調查了植物遠緣雜交廣泛實踐的基礎上，提出了植物遠緣雜交存在著染色體水平以下的DNA片段雜交假說[1]。在此基礎上外源總DNA通過花粉管通道導入受體技術得到了發展。近年來，花粉管通道技術在許多作物上都有應用，如水稻、小麥、玉米、大豆等，外源DNA導入技術的應用在多種植物上實現了目標性狀基因的轉移[2]。本試驗以普通玉米自交系為受體，以甘蔗為供體，用花粉管通道法將供體總DNA導入受體中，從中選出具有優良性狀變異的植株，并連續種植3代后，對其主要農藝性狀、生理生化指標測定(糖和蛋白質含量等)，從中選出優良變異株，為生產上提供雜交育種材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供體：甘蔗(新臺糖22號)；受體：普通玉米自交系7313(簡稱普7313)。

1.2 方法

1.2.1 外源DNA的制備 用氯仿-異戊醇-核糖核酸酶法[3]，對供體進行總DNA的提取，提取的DNA經島津UV-265紫外檢測和瓊脂糖凝膠電泳進行純度、濃度和片段大小的鑒定，符合導入條件，以1×SSC溶液配制DNA，濃度為300 μg·mL-1和500 μg·mL-1。

1.2.2 花粉管導入 選取自交授粉后18 h、20 h、22 h、24 h且抽絲期一致的普通玉米自交系7313果穗，剪去距穗頂部1.0 cm以上的苞葉和花絲，將供體DNA(甘蔗DNA濃度為300 μg·mL-1、500 μg·mL-1)溶液滴在切口處，每穗滴注量均在1.0 mL，2 h后重復滴注1次，共2次，同時滴注不含外源DNA的1×SSC溶液在受體植株上作對照。

1.2.3 后代植株的鑒定與選擇 將外源DNA導入受體后，選擇所獲得的變異株種植，按常規育種系譜法選育，選擇與受體(對照)表現不同的變異個體(如生育期、株型等性狀變異)，單株收種種植，經過3代選擇得到穩定株系，對穩定株系進行葉綠素(糖、蛋白質含量等)生理生化項目測定，對D₃代植株主要農藝性狀做顯著水平檢驗。

2 結果與分析

2.1 D₃代各株系性狀比較

將選擇所獲得的變異株果穗按穗行種植，觀察D₃代各株系農藝性狀，發現葉片形狀與顏色、百粒重、生育期等方面與受體對照(普7313)有差異，特別在株高和穗位葉葉長、葉寬、葉面積上差異顯著。結果見表1、表2。

從表1可看出，20-500株系抽雄期比對照提前3～6 d；抽絲期也比對照提前3～6 d；子粒數除18-300①外，其他都比對照增加，增幅為9.9%～71.94%，其中20-500①子粒數最多，比對照多182粒；百粒重22-300①和20-500①都比對照多，分別多4.38%和5.91%；生育期20-500株系都比對照提前3 d。

從表2可以看出，D₃代株系24-300、22-300①、22-300②、18-300①、18-300②、20-500①、20-500②株高與受體對照差異達顯著水平，而20-500③株系與受體對照差異不顯著；D₃代株系22-300①、22-300②、18-300②穗位葉葉長與受體對照差異顯著，其他與受體對照差異不顯著；D₃代株系22-300①、18-300②穗位葉寬與受體對照差異顯著，其他株系與受體對照差異不顯著；D₃代株系22-300①、22-300②、18-300②穗位葉葉面積與受體對照差異顯著，其他株系與受體對照差異不顯著。

2.2 D₃代植株葉綠素含量測定

葉綠素含量的測定用乙醇浸提法[4]。在玉米的灌漿期取玉米的正三葉的中上部分，以95%的乙醇浸提后分別在663nm、645nm測定吸光度。每株作兩個重復，結果見表3。

從表3可以看出，18-300①的總葉綠素含量比對照高1.39%，20-500①的總葉綠素含量比對照高 2.04%，20-500②的總葉綠素比對照高1.03%，其中以20-500①的總葉綠素含量最高，而22-300②最低。

2.3 D₃代植株可溶性糖、蛋白質含量測定

通過花粉管通道法，將甘蔗DNA導入普7313自交系后，D₃代株系各性狀基本穩定，從D₃代株系中選取果穗子粒進行可溶性糖、蛋白質含量測定(每個株系取5個果穗，測其平均數；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[5]，蛋白質含量測定采用微量凱氏法[7])。結果見表4。

從表4可以看出，D₃代穩定株系的可溶性糖和蛋白質含量各不相同，同受體對照相比有的增加，有的降低。20-500①和20-500②株系可溶性糖含量在自交授粉后25 d和30 d的含量均比受體對照高，其中最高的為20-500①株系，在授粉后25 d和30 d分別為4.41%和1.63%，比受體對照(分別為1.58%和1.28%)提高2.83和0.35個百分點，其他株系都比對照低；20-500①、20-500②、22-300①和22-300②株系蛋白質含量含量都比受體對照(8.29%)增加，增幅為0.03%～1.45%，其他株系都比對照低。

4 結論

1)應用花粉管通道法，得到的變異植株經過3代的選擇后，選出了矮稈、早熟的品系20-500①和20-500②，其可溶性糖含量、蛋白質含量、葉片葉綠素含量都比對照提高，可為今后的玉米育種工作提供中間材料。

2)目前由于玉米基礎材料資源的貧乏，所配出的組合遠不能適應生產的需要。為了拓寬基礎材料、豐富種質資源，通過外源DNA導入的方法改良創造了優良玉米自交系，引入遠緣物種有益性狀的基因，在變異十分豐富的后代材料中選出含有目標性狀基因的個體是完全可能的，從而為創造出新的種質資源提供了一種非常有效的途徑。

參考文獻：

[1] 周光宇，龔蓁蓁，王自芬.遠緣雜交的分子基礎——DNA片段雜交假設的一個論證[J].遺傳學報，1979，6(4)：405-412.

[2] 翁 堅，沈慰芳，王自芳，等.外源DNA導入棉花的分子驗證[J].生物化學與生物物理學報，1984，16(3)：325-326.

[3] 祁永紅，李春秋，陳喜昌，等.外源DNA導入玉米自交系獲得變異新品系[J].黑龍江農業科學，1998(5)：1-2.

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[5] 蔡武城.生物物質常用化學分析法[M].北京：科學出版社，1982.21-22.

[6] 南京農業大學.土壤農化分析(第2版)[M].北京：農業出版社，1992.257-259.

[7] 張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術(第2版)[M].北京：高等教育出版社.2001.48-52.

(責任編輯 鄭 威)