牛乳素真核表達載體的構建

摘要：以牛乳素為目的基因，構建含有組氨酸標簽、人生長激素信號肽的真核表達載體，為利用牛乳素在活體動物及培養細胞中的表達提供基因材料。用人工合成hGH-Lacf B的序列與T載體連接，用Xho I和BamH I酶切后與相應酶切處理的pVAX1連接，取陽性克隆質粒，用EcoR I和Xho I酶切回收含hGH的pVAX1載體，再與經過PCR擴增的his-Lacf B連接，酶切鑒定及測序。DNA序列分析表明，攜帶hGH、6×his和目的基因Lacf B已成功連接到真核表達載體pVAX1中。

關鍵詞：牛乳素；組氨酸標簽；人生長激素信號肽；真核表達

中圖分類號：Q513+.2；Q782；Q503 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2008)05-0501-02

Construction of the Eukaryotic Expression Vector Carrying Lactoferricin B

ZHANG Yu1，2，MA Feng-long2，LIU Huan-zhen2，QIAO Yan-liang2，ZHAO Yu-jun1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China；

2.Shandong Sinder Technology Limited Company，Qingdao 266061，Shandong，China)

Abstract：To provide the eukaryotic expression vector carrying 6x histidine-tag and human growth hormone in expremental animal and cell culture，according to the published nucleotide sequence of the lactofericin B and human growth hormone，synthesis sequence was ligated with pMT-18 vector. The product was digested with Xho I and BamH I，and then cloned into the plasmid pVAX1.The recombinant plasmid was digested with EcoR I and Xho I，got the pVAX-hGH，and ligating with the gene encoding for his-lacfB and amplified using PCR technique. The eukaryotic expression vector carrying hGH、6x histidine-tag and lactofericin B had been established and verified by partial DNA sequence analysis.

Key words：lactoferricin B；histidine tag；human growth hormone；eukaryotic expression

乳鐵蛋白(Lactoferrin，Lf)是一種分子量為70~80kD的糖蛋白，廣泛存在于乳汁、唾液、淚液等外分泌液或血漿、中性粒細胞中[1]。Lf雖然具有抗菌活性，但酶解Lf得到的抗菌肽的抗菌活性遠遠高于Lf[2]。牛乳素(Lactoferricin Bovine，Lfcin B)是Lf在酸性環境下經胃蛋白酶作用從N端釋放的一段由25個氨基酸殘基組成的小肽[3]。研究表明，Lfcin B具有抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌作用，同時還具有抗病毒和腫瘤的作用[4]。從天然來源分離Lfcin B時，產量低、費時長、工藝復雜、成本昂貴，而人工合成Lfcin B費用更高，無法大規模生產。因此，利用基因工程技術生產新型抗菌肽-Lfcin B具有重要意義和極高的商業價值。本研究擬以人生長激素信號肽為前導序列、以牛乳素基因Lacf B為目的基因序列，構建能在活體動物及培養細胞中進行定位表達的真核表達載體。為了準確地對真核表達載體構建的合理性及表達效率進行評價，我們引入了his-tag和hGH前導序列。該基因結構為下一步在活體動物及培養細胞中的表達打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

感受態Escherichia coli DH5α，由本室制備；真核表達載體pVAX1，本實驗室保存。工具酶Xho I、EcoR I、BamH I和T₄ DNA連接酶均為TaKaRa公司產品。細菌培養基所用的蛋白胨、酵母粉均為OXOID公司產品，瓊脂粉(日本)購自青島博維生物科技公司，DNA產物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自北京天根生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 重組真核表達載體pVAX-hGH-Lacf B的構建 根據已發表的編碼牛乳鐵蛋白肽(Lactoferricin B)25個氨基酸的mRNA序列，及人生長激素(hGH)的信號肽，合成hGH-Lacf B的全序列，共176bp。在5′端引入BamH I，hGH和Lacf B間插入EcoR I位點，在3′端引入Not I和Xho I酶切位點，與pMD18-T載體連接。用BamH I和Xho I雙酶切，取小片段插入相應酶切處理的pVAX1，T₄ DNA連接酶過夜連接，轉化感受態Escherichia coli DH5α，完成重組載體構建。

1.2.2 重組的真核表達載體pVAX-hGH-his-LacfB的構建 以pVAX-hGH-Lacf B為模板，設計含有組氨酸標簽的上下游引物，在上游、下游分別引入EcoR I、Xho I限制性酶切位點，擴增his-Lacf B片段，并用RGS-his-Lacf B替換質粒pVAX-hGH-Lacf B中的Lacf B，形成重組真核表達載體pVAX-hGH-his-Lacf B。引物序列如下：His-Lacf BU1：5′-GAATTCCATCACCATCACCATCACAAGTG

TAGAAGATGG-3’ 39bp；His-Lacf BD1：5′-CTCGAGGCGGCCGCTTAGAAAGCTCTTCTA-3′ 30bp；E-RGS-His：5′ACGAATTCATGAGAGGATCGCATCACCATCACCAT 3′。

2 結果與分析

2.1 重組的pVAX-hGH-Lacf B真核表達質粒的鑒定

重組的pVAX-hGH-Lacf B真核表達質粒經過限制性內切酶BamH I和Xho I雙酶切后所得小片段，為176bp大小，與插入的片段大小相一致，并取菌樣送測序公司測序，結果均正確(圖2)。

2.2 重組的pVAX-hGH-his-Lacf B真核表達質粒的鑒定

重組的pVAX-hGH-his-Lacf B真核表達質粒經過限制性內切酶EcoR I和Xho I雙酶切后所得小片段，為127bp大小，與插入的片段大小相一致，菌樣送測序公司測序，結果正確(圖3)。

3 討論

Lfcin B是乳中一種重要的乳清蛋白，具有非常廣泛的功能，許多研究已經證實Lfcin B在體內具有抑菌及殺菌作用并參與許多免疫反應[5]。奶牛乳房炎在奶牛業中是開支最為昂貴的一種疾病，主要由各種不同的病原菌引起。利用Lfcin B的抗菌、殺菌及調節免疫的作用，對于預防和治療奶牛乳房炎具有非常廣闊的應用前景。

本研究所選擇的載體pVAX1，是美國FDA認可的應用于核酸疫苗的表達載體，適合于DNA疫苗，便于短肽的表達。在載體構建中，我們引入了人生長激素(hGH)前導信號肽和組氨酸標簽(his-tag)。hGH是人腦垂體前葉分泌的一種蛋白質激素，由191個氨基酸殘基組成，它的主要功能是促進生長發育和維持組織器官的正常功能，增強細胞對氨基酸吸收和促進蛋白質合成，在此是為了促進蛋白質的分泌表達。his-tag的加入，為下一步表達蛋白的純化及鑒定打下了基礎。

本試驗成功地構建了牛乳素的真核表達質粒，為進一步研究牛乳素在真核細胞中的表達及其活性的測定打下了良好的基礎。目前本實驗室正在利用不同的轉染方法將真核表達質粒pVAX1-hGH-his-Lacf B轉入倉鼠腎細胞BHK-21，檢測其在BHK-21細胞中的表達情況，已取得一些試驗結果。

參考文獻：

[1] BELLAMY W，TAKASE M，YAMAUCHI K，et al. Identification of the bactericidal domain of lactoferrin[J]. Biochemet Biophy Acta，1992，1121：130-136.

[2] FENG X J，WANG J H. Fusion expression of bovine lactoferricin in Escherichia coli [J]. Protein Expression and Purification，2006，47：110-117.

[3] TOMITA M，BELLAMY W，TAKASE M，et al. Potent antibacterial peptides generated by pepsin digestion of bovine lactoferrin [J]. J Dairy Sci，1991，74：4137-4142.

[4] WAKABAYASHI H，MATSUMOTO H，HASHIMOTO K，et al. N-Acylsted and D enantiomer derivatives of a nonamer core peptide of lactoferricin B showing improved antimicrobial activity[J]. J Antimicrob Agents Chemother，1999，43：1267-1269.

[5] SEYFERT H M，HENKE M，INTERTHAL H，et al. Defining candidate genes for mastitis resistance in cattle the role of lactoferrin and lysozyme[J]. J Animal Breeding Genetics，1996，113：269-276.

(責任編輯 王 珞)