綿羊體外受精囊胚玻璃化冷凍保存的研究

摘要：以常規的慢速冷凍法為對照，研究了玻璃化冷凍法保存綿羊體外受精囊胚的效果。對于綿羊體外受精囊胚，兩種冷凍方法間的囊胚存活率沒有明顯差異，但玻璃化冷凍組的囊胚孵化率顯著高于慢速冷凍法組(分別為76.8%和41.0%，P<0.05)。將冷凍解凍后的綿羊囊胚移植后，玻璃化冷凍組的懷孕率和產羔率明顯高于慢速冷凍法的。同時比較了綿羊體外受精囊胚細胞取樣后，經不同時間培養后的玻璃化冷凍保存效果。囊胚取樣后培養2 h或5 h，胚胎冷凍解凍后的存活率和孵化囊胚率顯著高于對照組(分別為75.0%、50.0%，78.8%、69.7%和41.2%、26.5%，P<0.05)。培養10 h后，胚胎冷凍解凍后的存活率和孵化囊胚率有所降低。結果表明，應用玻璃化冷凍法可以較好的冷凍保存綿羊體外受精囊胚及切割取樣后的囊胚，綿羊體外受精囊胚切割取樣后，經過2～5h時的恢復培養可以提高其抗凍能力。

關鍵詞：綿羊；體外受精囊胚；慢速冷凍；玻璃化冷凍；細胞取樣

中圖分類號：S826；S814.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2008)05-0503-03

Study on Vitrification of Sheep IVF Blastocyst

ZHANG Jia-xin1，2，YANG Mei2，NIU Zhi-hong2，SHI Hong-cai2，GUO Zhi-qin2

(1. Key Lab of Animal Genetics，Breeding and Reproduction，Inner Mongolia Agricultural University，Huhehaote 010018，China；

2. Agricultural Ministry Biotechnology Key Laboratory，Xinjiang Animal Science Academy，Wulumuqi 830000，China)

Abstract：Vitrification and slow freezing of sheep IVF blastocysts were compared in this study. The blastocyst survival rates were similar between vitrification group and slow freezing group，but the hatched blastocyst rates were significantly higher after vitrification compared with slow freezing(76.8% and 41.0% respectively，P<0.05). After embryo transfer，the pregnancy and lambing rates within vitrification group were higher than that of slow freezing group. Vitrification of sheep blastocysts biospied at different intervals were studied. Higher survival rate and hatching blastocyst rate were obtained after culturing 2~5 hours than that of control(75.0%，50.0%，78.8%，69.7% and 41.2%，26.5% respectively，P<0.05). The survival rate and hatched blastocyst rate were decreased after biospied blastocyst culturing 10 hours. In conclusion，sheep IVF blastocysts and biospied blastocysts can be vitrified successfully，and vitrification of biospied blastocysts was improved after culturing 2~5 hours.

Key words：sheep；IVF blastocyst；slow freezing；vitrification；biopsy

動物胚胎的冷凍保存是一項重要的生物技術，它不僅對于低溫生物學基礎研究具有重要的意義，而且對于生產實踐、動物胚胎的商業化應用具有很大的促進作用。與常規的慢速冷凍相比，玻璃化冷凍具有操作簡單、冷凍效率高的優點[1，2]。盡管綿羊胚胎的玻璃化冷凍也獲得成功[3-5]，但是有關體外受精胚胎的玻璃化冷凍報道卻很少，特別是顯微操作后的綿羊體外受精胚胎。對胚胎的遺傳物質進行早期分析需要取樣，主要是從胚胎上取下一些細胞用于檢測。取樣過程對新鮮胚胎的活力沒有影響，但是取樣后的胚胎冷凍解凍后的發育能力卻下降[6]。我們以慢速冷凍為對照，研究了綿羊體外受精囊胚的玻璃化冷凍保存效果及其解凍后的移植效果，同時比較了綿羊體外受精囊胚細胞顯微取樣后，經不同時間培養后的玻璃化冷凍保存效果。從而為綿羊體外受精胚胎的相關研究和應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 卵母細胞的收集、體外成熟

從屠宰場剛宰殺的綿羊體內剪下卵巢，在3h內運回實驗室。在超凈工作臺內，從卵巢表面上直徑為2～5 mm的卵泡中抽取卵母細胞，在顯微鏡下挑選出含有完整卵丘細胞層、胞質均勻的卵母細胞。將選出的卵母細胞用成熟液洗3次，然后將15枚卵母細胞放入50 μL的成熟液滴中，在38.6℃，5%CO2，飽和濕度的培養箱中培養24～26 h。成熟液組成為TCM1999(Sigma)+10%FBS(Hyclone)+3.6 μg·mL^-1 FSH(中國科學院動物所)+6 μg·mL^-1 LH(中科院動物所)+1 μg·mL^-1雌二醇(Sigma)。

1.2 體外受精

在超凈工作臺中剖開新鮮的睪丸，將附睪尾部剪碎，把碎片放入受精基礎液SOFM，在39℃的溫箱中懸浮30～50 min，然后移入10mL試管中。用SOFM將精子懸浮液離心洗滌兩次(5 min，1 500 r·min^-1)，然后用受精液(SOFM+20%綿羊血清)重懸浮精子，并在38.6℃下孵育30 min。同時，將成熟的卵母細胞在0.05%的透明質酸酶(Sigma)液中反復吹打沖洗一次，除去部分卵丘細胞，保留2～3層卵丘細胞。用受精液將卵母細胞洗滌3次后將15～20枚成熟卵母細胞放入50 μL受精液中，加入孵育后的精子至5×106精子·mL^-1，并放入CO2培養箱中培養。

1.3 受精卵的體外培養

精卵共培養20 h后，將受精卵用培養液洗滌3次，并用吸管反復吹吸，去除吸附的多余精子后，將10～15枚受精卵移入50 μL培養液滴中。培養液為SOFM+1%NEAA(Gibco)+1%EAA(Gibco)+1mmol 谷氨酰胺(Sigma)+5 U·mL^-1胰島素(Sigma)+3

mg·mL^-1BSA(Sigma)。受精后48 h將受精卵移入含有10%犢牛血清的培養液中。每隔48 h換2/3培養液，換液時觀察胚胎發育情況。在體外受精后第7天檢查各試驗組胚胎發育情況。

1.4 胚胎取樣

胚胎用操作液洗滌兩次后，移入20 μL的操作液滴，操作液是添加了7.5 μg·mL^-1細胞松弛素B的無鈣、鎂離子的SOFM液。在顯微操作儀上用吸管從胚胎上吸取7～8個細胞，取樣后，胚胎用培養液洗滌3次后，移入培養液滴中，按試驗設計在CO2培養箱中培養不同時間后冷凍保存。

1.5 胚胎冷凍

慢速冷凍：以DPBS為基礎液，添加3 mg·mL^-1 BSA、1.8 mol乙二醇、0.05 mol海藻糖組成。在室溫(25℃)下，將胚胎置于冷凍液中平衡5 min后裝入0.25 mL的細管，將細管放入冷凍儀。然后啟動冷凍程序，從0℃以1℃·min^-1降到-6.7℃，置冰后平衡10 min。然后以0.3℃·min^-1降到-30℃，再直接投入液氮保存。解凍時，將細管從液氮中取出，在空氣中停留5 s，然后放入37℃水浴10 s，隨后將胚胎移入培養液中，胚胎用培養液洗滌3次后，在培養液滴中繼續培養48 h并觀察胚胎發育情況。

玻璃化冷凍：所有玻璃化冷凍液的基礎液是DPBS添加0.3 mmol的丙酮酸鈉和3.3 mmol葡萄糖。在室溫下(25℃)，將胚胎移入平衡液1(基礎液+10%血清+10%甘油)中平衡5 min，然后在平衡液2(基礎液+10%血清+10%甘油+20%乙二醇)中平衡5 min，然后將胚胎直接移入玻璃化液(VS，基礎液+10%血清+25%甘油+25%乙二醇)中，并投入液氮。

解凍時，從液氮中取出細管，在37℃水浴中解凍10 s，將細管中的胚胎排入0.5 mol蔗糖液中，迅速揀出胚胎，并移入0.25 mol蔗糖液中平衡5 min，把胚胎用培養液洗滌3次，培養2 h并觀察胚胎恢復發育情況。

1.6 受體羊處理及胚胎移植

受體母羊進行同期化處理，母羊陰道埋植孕酮海綿栓12 d，在撤栓前每只羊肌肉注射2支氯前列烯醇，同時注射400國際單位PMSG。此后每天用試情公羊早晚各試情一次直至發情。發情后第7天，將受體羊麻醉，固定于手術架上，在腹中線切一個小口，將子宮取出，在有黃體一側的子宮角用鈍針頭插一個小孔，將2枚胚胎移入子宮角。45d后用B超檢查懷孕情況。

1.7 統計分析

所有試驗重復3次，獲得的數據均用卡平方(χ2)檢驗并進行統計分析，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

從表1可知，綿羊體外受精囊胚冷凍解凍后，慢速冷凍法和玻璃化冷凍法兩組間的囊胚存活率沒有顯著差異(分別為85.4%和83.3%，P>0.05)，但玻璃化冷凍法組的孵化囊胚率明顯高于慢速冷凍法組(76.8%和41.0%，P<0.05)。從表2可知，玻璃化冷凍解凍后的綿羊體外受精囊胚，移植后的懷孕率和產羔率明顯高于慢速冷凍組的(P<0.05，分別為52.3%、34.1%和27.8%、11.1%)。從表3可知，綿羊體外受精囊胚取樣后，培養2 h或5 h，胚胎冷凍解凍后的存活率和孵化囊胚率顯著高于對照組(分別為75.0%、50.0%、78.8%、69.7%和41.2%、26.5%，P<0.05)。培養10 h后，胚胎冷凍解凍后的存活率和孵化囊胚率有所降低，但差異不顯著。

3 小結與討論

玻璃化冷凍是指利用物理學原理將高濃度的冷凍保護劑急速降溫后，由液態轉化為外形類似玻璃狀的穩定而透明的非晶體化固體狀態[1]。玻璃化狀態可以抑制冰晶的形成，有報道表明，玻璃化冷凍可以減少低溫對胚胎的損害，例如對細胞內脂滴和細胞膜的破壞，以及細胞骨架的損傷，從而提高胚胎冷凍后的存活能力[7]。

體外受精胚胎含有高比例的脂類，這使得體外受精胚胎對低溫的影響更加敏感[8]。目前，慢速冷凍法仍然是國際上常用的胚胎冷凍方法。但是，在慢速冷凍過程中，由于降溫速度比較慢，從而導致胚胎內更容易形成冰晶，這對于脂類含量高的體外受精胚胎則損害增加。玻璃化冷凍采用高濃度的冷凍劑和快速的降溫速度，在一定程度上避免了冰晶的形成以及由此而造成的對體外受精胚胎的損害。本試驗的結果表明，綿羊體外受精囊胚用玻璃化冷凍法冷凍保存后，其存活的囊胚孵化率、移植后懷孕率以及產仔率都明顯高于慢速冷凍法的。與慢速冷凍相比，玻璃化冷凍法更適合綿羊體外受精胚胎的冷凍保存，這與已報道的牛的結果相似[7，9]。

目前主要有兩種方法用于胚胎取樣，一種是用刀片將胚胎的一部分細胞和透明帶切下[10]；另一種是用吸管在透明帶下吸取一部分胚胎細胞[11]。前者方法簡單，但是易對胚胎造成損傷；相反胚胎透明帶下吸取的方法對胚胎的損傷較小。對于牛胚胎，在胚胎上穿孔后，利用玻璃吸管從胚胎上吸取一些細胞后要比刀片切割后獲得較高的懷孕率[11]。我們的結果表明，綿羊體外受精囊胚取樣后，經過一段時間培養(2～5 h)，可以明顯提高其對冷凍解凍過程的抵抗力，但是過長時間培養會降低胚胎冷凍解凍后的存活率。這與以前的有關報道結果相似，冷凍前過長時間的培養會導致牛半胚對冷凍的抵抗力下降[11，12]。

總之，應用玻璃化冷凍液可以較好地得到冷凍保存綿羊體外受精囊胚及切割取樣后的囊胚，綿羊體外受精囊胚切割取樣后，經過2～5 h的恢復培養可以提高其抗凍能力。

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(責任編輯 王 珞)