灰樹花斜面母種培養(yǎng)基的優(yōu)化

摘要：試驗(yàn)在傳統(tǒng)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別從葡萄糖單因素培養(yǎng)、合成培養(yǎng)基正交培養(yǎng)與半合成培養(yǎng)基正交培養(yǎng)3個(gè)角度或?qū)哟螌?duì)灰樹花(Grifola frondosa)母種斜面培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化探討。結(jié)果表明，適合灰樹花菌絲生長(zhǎng)的最佳斜面培養(yǎng)基配方為土豆200g 、麩皮100 g、玉米面100 g、板栗殼100 g、葡萄糖20 g、林地土20 g、蛋白胨1 g、瓊脂20 g、CaCl₂ 0.1 g、KH₂PO₄1 g、FeSO₄ 1 g、MgSO₄ 0.5 g、ZnSO₄ 0.01 g、水1L、pH值6.0。該配方既可為灰樹花母種的制備提供依據(jù)，又能為灰樹花的大面積栽培以及為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)而進(jìn)行的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：灰樹花；母種；培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S646.1+9；S603.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114(2008)05-0553-05

Optimization of Mother Strain Slope Media for Grifola frondosa

XU Hui-cai1，WANG Wei-guo2，HOU Qi-chang3，ZHAO Yong-liang1

(1.Jiaozuo Normal College，Jiaozuo 454000，Henan，China；2. Bioengineering Dept.，Henan University of Industry ，Zhengzhou 450001，China；3. Henan College of Broadcast-TV，Zhengzhou 450051，China)

Abstract：Optimization of mother strain slope media for Grifola frondosa was researched by single factor culture with glucose，synthetic media culture and semi-synthetic media culture based on the traditional mother strain slope medium. The results showed that the best mother strain slope medium components (MSM) were 200g of potato，bran 100g，corn powder 100g，the chestnut hull 100g，glucose 20g，wooden soil 20 g，peptone 1g，agar 20 g，CaCl₂ 0.1g，KH₂PO₄ 1g，F(xiàn)eSO₄ 1g，MgSO₄ 0.5g，ZnSO₄ 0.01g，water 1L，pH6.0，which was suitable for the culture of Grifola frondosa. It was helpful for the preparation of mother strain slope medium and the foundation of solid culture and liquid submerged fermentation of Grifola frondosa.

Key words：Grifola frondosa；mother strain；culture media；optimization

灰樹花(Grifola frondosa)又名蓮花菌，具有獨(dú)特的芳香味，營(yíng)養(yǎng)豐富，口味鮮美，且含有大量的生物活性物質(zhì)，是一種珍貴的食、藥兩用真菌。近20年的研究發(fā)現(xiàn)，灰樹花中含有一種抗艾滋病抗惡性腫瘤成分——灰樹花多糖(Grifolan)。大量的化學(xué)和藥理分析表明，灰樹花多糖具有明顯的抗HIV(艾滋病病毒)，抗腫瘤，改善免疫系統(tǒng)功能，調(diào)節(jié)血糖、血脂及膽固醇水平、降低血壓等作用，對(duì)防止癌細(xì)胞的生成和轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)艾滋病、高血壓、肥胖癥、糖尿病以及免疫系統(tǒng)功能的紊亂都有很好的療效，且無(wú)任何毒副作用，其機(jī)制是通過(guò)強(qiáng)化機(jī)體免疫系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)的。研究表明，灰樹花多糖能明顯改善荷瘤機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞的功能，增加淋巴母細(xì)胞百分率，提高T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答功能，即提高細(xì)胞免疫功能；另外灰樹花多糖能明顯刺激溶血素的產(chǎn)生，即對(duì)體液免疫功能有增強(qiáng)作用，并能誘導(dǎo)IL-I、IL-II的生成，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，顯著拮抗常規(guī)化療、放療引起的免疫功能降低[1-17]。最新試驗(yàn)證明，灰樹花多糖的抑瘤率可達(dá)86%以上，對(duì)AIDS(艾滋病)的抑制率為70%以上，比目前廣泛用于臨床的香菇多糖還要好，AIDS病人服用灰樹花多糖6周后，HIV陽(yáng)性即可轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮浴Ｒ虼耍覙浠ㄌ崛∥镒鳛榘┌Y的有效抑制劑，最近已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)直接進(jìn)入二期臨床。

目前關(guān)于灰樹花的研究與開發(fā)已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者及研發(fā)機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注，而灰樹花斜面母種的培養(yǎng)是從事一切關(guān)于灰樹花研究與開發(fā)工作的基礎(chǔ)，無(wú)論是固體栽培還是液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，都需要有優(yōu)良的母種，而且配制固體栽培和液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基時(shí)均要參考其斜面培養(yǎng)基。但就目前大多數(shù)研究者采用的PDA等斜面母種培養(yǎng)基來(lái)看，灰樹花菌絲在其上的生長(zhǎng)情況并不是很好，一般的土豆汁培養(yǎng)基不能滿足灰樹花菌絲生長(zhǎng)的需要，菌絲在其上生長(zhǎng)稀薄，色澤淡白，不均勻且生長(zhǎng)周期長(zhǎng)(是一般菇類的2～3倍)。雖然國(guó)內(nèi)外關(guān)于灰樹花液態(tài)發(fā)酵用的培養(yǎng)基的探討報(bào)道較多[18-21]，但關(guān)于灰樹花斜面母種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)的報(bào)道卻很少。本試驗(yàn)以目前在食用菌種植上廣泛使用的灰樹花菌株為對(duì)象，在傳統(tǒng)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別從葡萄糖單因素培養(yǎng)、合成培養(yǎng)基正交培養(yǎng)與半合成培養(yǎng)基正交培養(yǎng)3個(gè)角度或?qū)哟螌?duì)灰樹花斜面母種培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化探討。以期能為灰樹花母種的制備提供依據(jù)，更為灰樹花的大面積栽培以及為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)而進(jìn)行的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試劑與營(yíng)養(yǎng)物、藥品有葡萄糖、蔗糖、淀粉、蛋白胨、馬鈴薯、麩皮、玉米面、板栗殼、瓊脂、多維片、75%酒精、KH₂PO₄、MgSO₄、CaCl₂、FeSO₄、ZnSO₄、MnSO₄、VB₁、VB₂、NaOH、HCl、鉬酸銨、硫酸銨、酵母粉等。菌株為灰樹花(Grifola frondosa Sd)。儀器為試驗(yàn)室常用的酸度計(jì)、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、分析天平等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖單因素試驗(yàn) 此試驗(yàn)在原傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨1 g、(NH₄)₂SO₄ 2 g、KH₂PO₄1 g、MgSO₄1 g、瓊脂20 g，pH值6.5)的基礎(chǔ)上進(jìn)行，主要目的是確定不同的葡萄糖碳源添加量對(duì)灰樹花菌絲生長(zhǎng)影響的顯著性。共分葡萄糖20、30、40、50、60 g 5個(gè)水平，每個(gè)水平做5支試管，共做25支試管，培養(yǎng)15 d后觀測(cè)其菌絲長(zhǎng)度與外觀生長(zhǎng)長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.2 斜面合成培養(yǎng)基正交試驗(yàn)[22] 此試驗(yàn)是在葡萄糖單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽及pH值為5個(gè)因素，以其分別加入不同的4種配料或量作為4個(gè)水平，進(jìn)行5因素4水平正交試驗(yàn)，共做16個(gè)組合，每個(gè)組合重復(fù)3次，共做48支試管。斜面合成培養(yǎng)基正交試驗(yàn)的因素水平組合見表1。同時(shí)以麩皮培養(yǎng)基配方(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨1 g、玉米面150 g、麩皮150 g、(NH₄)₂SO₄2 g、KH₂PO₄1 g、MgSO₄0.5 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值6.5)試驗(yàn)做對(duì)照。培養(yǎng)20 d后觀測(cè)各自的菌絲長(zhǎng)度與長(zhǎng)勢(shì)(如色澤、均勻度等)。

1.2.3 斜面半合成培養(yǎng)基正交試驗(yàn) 因?yàn)榛覙浠ㄉL(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)要求相對(duì)較高，完全合成培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)素不能滿足其生長(zhǎng)需要，因此以合成培養(yǎng)基正交試驗(yàn)的優(yōu)選結(jié)果為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了斜面半合成培養(yǎng)基正交試驗(yàn)。為避免完全合成培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的不足，其營(yíng)養(yǎng)素氮源用麩皮替代，生長(zhǎng)因子用玉米粉和15%的板栗殼汁，無(wú)機(jī)鹽用天然混合型的林地土，以其為4個(gè)不同因素，用不同的添加量作為3個(gè)水平來(lái)做4因素3水平正交試驗(yàn)(共做9個(gè)組合)，每個(gè)試驗(yàn)組合重復(fù)3次，共做27支試管，詳情見表2，其上半部分為不同因素與水平，下半部分為共用原料。從有明顯生長(zhǎng)現(xiàn)象起，每3 d(中午12∶30)測(cè)定記錄一次菌絲生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)滿20 d后再最終測(cè)其菌絲長(zhǎng)度與長(zhǎng)勢(shì)(如色澤、是否布滿、均勻度等)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖單因素試驗(yàn)結(jié)果

葡萄糖單因素試驗(yàn)的結(jié)果見表3和圖1。從圖1可以看出，葡萄糖用量在40 g時(shí)菌絲長(zhǎng)度最大，50 g時(shí)最小，但其最大差值僅5.4 mm。這可能是速效性碳源抑制的結(jié)果。同時(shí)對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)5個(gè)水平間差別也不顯著，所以葡萄糖對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不大。鑒于此，需做正交試驗(yàn)，以確定對(duì)灰樹花生長(zhǎng)影響最大的因素，選出最佳的培養(yǎng)基配方。

2.2 斜面合成培養(yǎng)基正交試驗(yàn)的結(jié)果

斜面合成培養(yǎng)基正交試驗(yàn)的方案與結(jié)果見表4。斜面合成培養(yǎng)基正交試驗(yàn)的結(jié)果中不同因素對(duì)應(yīng)的極差R值見圖2。從正交試驗(yàn)結(jié)果與圖2可以看出，因素3生長(zhǎng)因子與4無(wú)機(jī)鹽對(duì)灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響均較大，其中，因素3生長(zhǎng)因子的影響為最大，因素2氮源的影響最小，說(shuō)明灰樹花菌絲的生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件的確有較高的要求。氮源對(duì)其影響最小，說(shuō)明其對(duì)氮源需求較廣泛。根據(jù)極差R的大小可以推知，對(duì)灰樹花菌絲生長(zhǎng)影響大小的順序依次為C>D>E>A>B。最終優(yōu)選出的合成培養(yǎng)基配方為A4B₁C₃D₄E₂，具體組成見表5。盡管優(yōu)選出了完全的合成培養(yǎng)基配方，但就菌絲外觀生長(zhǎng)狀況來(lái)看，并不比優(yōu)化前的好多少，有的甚至還不如原培養(yǎng)基，而且綜合比較，雖然菌絲生長(zhǎng)速度有的較麩皮培養(yǎng)基上的快一些，但考慮到色澤、均勻度與厚度時(shí)，明顯在麩皮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的更好一些。所以，添加麩皮、玉米面、板栗殼汁等營(yíng)養(yǎng)成份不能完全明確定量，但營(yíng)養(yǎng)比較全面且成本較低的原料進(jìn)行半合成培養(yǎng)基的正交優(yōu)化試驗(yàn)是很有必要的。另外，在完全的合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰樹花菌絲的長(zhǎng)勢(shì)并不是特別好，只有少數(shù)長(zhǎng)得不錯(cuò)。特別有意義的是，通過(guò)該項(xiàng)研究，我們發(fā)現(xiàn)了灰樹花菌絲能在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這對(duì)于進(jìn)一步探討灰樹花的生理生化及遺傳等特性具有重要價(jià)值。

2.3 斜面半合成培養(yǎng)基正交試驗(yàn)的結(jié)果

斜面半合成培養(yǎng)基正交試驗(yàn)的方案與結(jié)果見表6。對(duì)表6的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，并對(duì)R值做圖(圖3)，結(jié)果可知，4因素中對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響最大的竟是林地土。由于林地土不僅富含有機(jī)質(zhì)，更富含礦物質(zhì)，林地土對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響的顯著性再次說(shuō)明了灰樹花生長(zhǎng)需要較高的營(yíng)養(yǎng)條件，完全的合成培養(yǎng)基不能滿足其生長(zhǎng)所需的多種營(yíng)養(yǎng)素。影響最小的是氮源，與合成培養(yǎng)基條件下正交試驗(yàn)的結(jié)果相一致。另外，該試驗(yàn)菌絲長(zhǎng)度的測(cè)量所用的斜面生長(zhǎng)狀況較好，色澤白且均勻，同時(shí)測(cè)量長(zhǎng)度還就原新培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況、色澤、布滿度、均勻度4種情況進(jìn)行了比較，其結(jié)果更具有科學(xué)性和指導(dǎo)性。在考慮菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度的同時(shí)參考其他4種生長(zhǎng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)加林地土的斜面上菌絲長(zhǎng)勢(shì)、色澤、布滿度與均勻度均普遍較好，說(shuō)明這一物美價(jià)廉的林地土在灰樹花開發(fā)生產(chǎn)上是大有作為的。無(wú)論是灰樹花的固態(tài)栽培還是液態(tài)深層培養(yǎng)，均應(yīng)考慮林地土的添加，這不僅有利于高產(chǎn)，還可以大大降低生產(chǎn)成本。

由K值的大小得最佳培養(yǎng)基配方為：A₃B₂C₂D₂；但鑒于因素A相對(duì)影響小，而麩皮粉碎相對(duì)比較麻煩，故最后選用的最佳培養(yǎng)基配方為A₂B₂C₂D₂。

3 小結(jié)與討論

經(jīng)過(guò)6個(gè)多月的優(yōu)化探討，分別通過(guò)葡萄糖單因素試驗(yàn)、合成培養(yǎng)基正交試驗(yàn)與半合成培養(yǎng)基正交試驗(yàn)后，最終找出了灰樹花菌絲生長(zhǎng)情況最佳的斜面母種培養(yǎng)基配方，以MSM(mother strai slope medium)表示，組成見表7。MSM與原(傳統(tǒng))培養(yǎng)基配方(表1)相比，配方上增加了麩皮、玉米面、板栗殼、林地土、CaCl₂、FeSO₄等物質(zhì)。麩皮、玉米面是既可作為碳源、氮源，也可作為生長(zhǎng)因子的天然混合營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而板栗殼更是最佳的生長(zhǎng)因子，林地土則主要提供了天然混合的灰樹花菌絲生長(zhǎng)所必須的微量元素?zé)o機(jī)鹽，同時(shí)滿足了灰樹花菌絲生長(zhǎng)所需量較大的Ca²⁺和Fe²⁺。加上補(bǔ)充了純CaCl₂、FeSO₄等，最大程度地滿足了灰樹花菌絲的生長(zhǎng)所需，使灰樹花菌絲在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度提高了40%，且色澤純白，生長(zhǎng)均勻濃厚。

筆者曾經(jīng)用MSM培養(yǎng)基擴(kuò)培了另外廣泛使用的2株灰樹花菌株(G.a frondosa Sf和G. frondosa Sk)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)20 d后菌絲均能基本長(zhǎng)滿斜面，且生長(zhǎng)外觀濃白、均勻，說(shuō)明我們優(yōu)選出的這種配方不僅僅適合一個(gè)灰樹花品種的培養(yǎng)，對(duì)其他灰樹花菌株也很適合。

以上結(jié)果充分表明，灰樹花母種斜面培養(yǎng)基的優(yōu)化是成功的，這不僅為灰樹花母種生產(chǎn)提供了優(yōu)良的培養(yǎng)基，更為灰樹花的大面積栽培以及為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)而進(jìn)行的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 王 珞)