紅法夫酵母甘露聚糖的提取與鑒定

摘要：酸性條件下高溫高壓水解紅法夫酵母，然后經冷甲醇、十六烷基三甲基溴代銨 (CTAB) 、乙醇多級沉淀及Sephadex G-150純化、干燥后，得到白色提取物粉末，采用紅外光譜、紫外掃描、氣相色譜進行分析，確定粉末為甘露聚糖，其得率為8.3%，甘露聚糖中甘露糖與葡萄糖含量之比為4∶1，并含有一定量的結合蛋白。

關鍵詞：甘露聚糖；紅法夫酵母；提取；鑒定

中圖分類號：TQ926.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2008)05-0584-03

Extraction and Characterization of Mannan by Phaffia rhodozyma

WANG Wen-jun1，LIU Yu-lan2，XIAO Jing3，QI Jing3，LAI Yi-lin3

(1.College of Life Science，South-central University for Nationalities，Wuhan 430074，China；

2.Hubei Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China；

3.College of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China)

Abstract：In this paper the yeast cell of Phaffia rhodozyma was hydrolyzed under acid condition at high temperature and press and then the extract was obtained after the hydrolysate treated with cool methanol，CTAB，ethanol and Sephadex G-150，and mannan was identified by assay of infrared spectroscopy，ultraviolet scanning and gas chromatogram. The result indicated that the extractability was 8.3% and the ratio of mannose and glucose of mannan was 4∶1 with part of binding protein.

Key words：mannan；Phaffia rhodozyma；extraction；characterization

甘露聚糖是由甘露糖和葡萄糖通過β糖苷鍵連接而成的高分子多糖[1]，其無色、無毒和無異味，是一種既經濟且高效的天然食品防腐劑，能有效地防止食品腐敗變質、發霉和遭受蟲害[2]，具有免疫調節功能，對腫瘤、心血管疾病的防治有獨特的效果[3]，具有抗病毒、細菌和真菌感染、抗腫瘤、抗氧化和抗輻射、促進傷口愈合的生理活性[4]。最近的許多研究表明，酵母細胞壁中甘露聚糖對霉菌毒素有很強的吸附作用，能有效抵抗霉菌毒素的毒性[5-7]。

紅法夫酵母是可以利用多種碳源合成蝦青素為主要色素的酵母，通常提取蝦青素之后的紅法夫酵母殘渣作為廢棄物扔掉，未能很好的綜合利用，為此本文研究了從紅法夫酵母細胞壁中提取甘露聚糖的工藝條件，并對提取物進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養條件

紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)4℃保藏于YM斜面。YM培養基(%)：葡萄糖1、酵母浸粉0.3、蛋白胨0.5、麥芽汁0.3、瓊脂2(用于制作平板時添加)，pH 5.0。發酵培養基(%)：葡萄糖5、酵母浸粉0.8、KH₂PO₄ 0.5、NaH₂PO₄ 0.1、MgSO₄ 0.2，自來水配制，pH值5.0。斜面上挑取一環菌種于YM培養基中，培養過夜后種子液以10%接種量接種到500 mL三角瓶(含有YM培養基50 mL)中，18℃、200 r·min^-1下搖床振蕩培養36 h制備種子液，將種子液按10%接種量接種到5 L全自動發酵罐(Biostat 5，B. Braun，Germany，工作體積為3 L)中于20℃、攪拌速度200 r·min^-1、通氣量為0.36 vvm下進行培養80 h。

1.2 甘露聚糖提取工藝條件

取3 000 mL發酵液，6 000 r·min^-1離心8 min收獲酵母細胞，以0.2 mol·L^-1檸檬酸緩沖液(pH值7.2)洗滌兩次后離心，按100 mL·100 g^-1濕細胞的比例加入相當體積的0.2 mol·L^-1檸檬酸緩沖液(pH值7.2)，在自動滅菌鍋中0.1 MPa下處理90 min，冷卻后6 000 r·min^-1離心8 min，收集上清液，加入75 mL檸檬酸緩沖液溶解離心所得殘留物，重復以上步驟，將兩次上清液合并，冷至4℃左右后加3倍體積冷甲醇，4℃靜置過夜。過夜液6 000 r·min^-1離心8 min得白色沉淀，于60℃烘箱中干燥，干燥物中加入100 mL水溶解，慢慢加入7.2%的CTAB溶液，并不時攪拌，室溫下放置過夜。過夜液6 000 r·min^-1離心8 min，傾去上清，以0.5% pH值8.8硼酸鈉溶液洗滌，6 000 r·min^-1離心8 min取沉淀，溶于50 mL 2%乙酸溶液中，加1 g乙酸鈉晶體，充分溶解后加8倍體積乙醇，得白色沉淀，60℃烘箱中干燥得白色粗多糖。取粗多糖進行Sephadex G-150柱層析純化，以0.9%氯化鈉溶液洗脫，控制流速約0.6 mL·min^-1，每管收集3 mL，分部收集。每管吸取少量收集液，硫酸-蒽酮法檢測[8]，按照管號對光密度繪制洗脫曲線，將最大峰處的洗脫液合并，減壓濃縮、干燥，得到白色粉末狀精制多糖，稱重(單位g)。

1.3 分析方法

1.3.1 提取物重量測定 分別將經冷甲醇、CTAB和乙醇沉淀得到提取物于105℃烘箱中干燥至恒重后稱重(單位g)。

1.3.2 提取物總糖測定 采用硫酸-苯酚法測定每次得到的提取物總糖含量[8]。

1.3.3 提取物光譜檢測 將精制多糖經KBr壓片，在EQUINOX55型傅里葉變換紅外光譜儀上4 000～400 cm-1區間紅外掃描。取少量樣品溶入0.05 mol·L^-1 NaOH溶液中，在島津UV-240型紫外分析儀于190～400 nm范圍掃描。

1.3.4 提取物中單糖成分測定

1)樣品的完全水解 準確稱取精制多糖200 mg，加入少許蒸餾水，加入3 mL 1 mol·L^-1的H₂SO₄，定容至10 mL，密封后于滅菌鍋中0.1 MPa下水解10 h，溶液在40℃水浴中用碳酸鋇緩慢中和至pH值7.0，3 000 r·min^-1離心10 min備用。

2)氣相色譜(GC)分析 取1 mL水解產物干燥后，加入鹽酸羥胺 90 mg、吡啶4 mL，在90℃的水浴中加熱反應20 min并不斷振蕩。取出后冷至室溫，加4 mL乙酸酐置于90℃水浴20 min進行乙?；磻?，得精制多糖水解物的糖腈乙酰酯衍生物。準確稱取L-鼠李糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖標準品各10 mg，以相同方法制備標準品的標準單糖的糖腈乙酰酯衍生物，進行GC分析。色譜條件OV-225毛細管柱，柱溫190℃，FID檢測器，氣化室與檢測器溫度240℃，載氣為氮氣，流速30 mL·min^-1，氫氣流速48 mL·min^-1，樣品與標樣各進樣2 μL。根據保留時間與標樣對照分析[9，10]。

2 結果與分析

2.1 多糖多級沉淀結果

采用冷甲醇、CTAB和乙醇進行了多級沉淀，每次沉淀后干燥稱重，結果如圖1所示。圖中1為經過冷甲醇沉淀所得提取物，2為經過冷甲醇和CTAB沉淀所得提取物，3為經冷甲醇、CTAB和乙醇沉淀所得多糖提取物，4為經Sephadex G-150柱層析后得到精制樣品。用50 g鮮酵母(干重7.2 g)進行提取，冷甲醇沉淀得到白色粗提物約有3.3 g，經過CTAB處理后得到的白色提取物2.1 g，再經乙醇沉淀精制的白色提取物1.60 g，經Sephadex G-150柱層析純化后冷凍干燥得到精制樣品0.6 g，即最終得率為8.3%。

2.2 多糖柱層析純化結果及產物理化性質

粗多糖樣品經Sephadex G-150柱層析，分部收集液用硫酸-蒽酮法檢測后，得到的洗脫曲線僅含有一個較大且狹窄洗脫峰(圖2)，可見所得產物已很純，將最大峰洗脫液經合并濃縮，干燥得白色多糖精制樣品，其微溶于水，可溶于稀堿液，不溶于乙醇、丙酮、二甲亞砜等有機溶劑，總糖含量為84%。

2.3 紅外光譜分析

精制樣品經KBr壓片，在4 000～400 cm-1區間進行紅外光譜掃描。紅外圖譜中含有多個多糖類物質的特征吸收峰(圖3)[11]，在3 420.1 cm-1處有強的O-H鍵的伸縮振動引起的特征吸收，在2 936 cm-1和1 393 cm-1處有兩組糖類C-H的伸縮振動引起的特征峰，分別代表了糖類C-H伸縮振動與變角振動，870及810 cm-1處有不明顯吸收峰，說明含甘露糖，在1 641 cm-1處有C-O非對稱伸縮振動峰，

1 073 cm-1處為O—H變角振動峰，紅外光譜在

1 700～1 775 cm-1范圍內沒有吸收，表明其不含葡萄糖醛酸。在898 cm-1的強吸收峰，顯示該多糖為β-吡喃構型。因此可推斷該樣品為一種β-吡喃多糖。

2.4 紫外光譜掃描分析

將提取最終精制樣品配制成0.5 mg·mL^-1的水溶液進行紫外掃描，掃描波長190～400 nm，結果見圖4?？梢娫?14 nm處有一個很強的多糖特征吸收峰，在280 nm處有一個中等強度的吸收峰，該峰應該是甘露聚糖結合蛋白的蛋白吸收峰，可見多糖中含有一定量的蛋白。

2.5 氣相色譜分析單糖種類及含量

精制樣品的糖腈乙酸酯氣相色譜圖中出現而個組分峰，通過與標準單糖保留時間的對比，確定為甘露糖和葡萄糖，說明精制樣品中含有甘露糖和葡萄糖，根據二者的峰面積可知在甘露聚糖中甘露糖與葡萄糖的含量之比為4∶1(圖5，圖6)。綜合前面的分析可知樣品應為甘露聚糖。

3 結論

通過提取、多級沉淀和Sephadex G-150柱層析得到精制樣品，采用紅外光譜、紫外掃描、氣相色譜進行分析，確定提取精制樣品為甘露聚糖，其得率為8.3%，甘露聚糖中甘露糖與葡萄糖含量之比為4∶1，并含有一定量的結合蛋白。

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(責任編輯 鄭 威)