葡萄球菌生物膜檢測(cè)及與耐藥性的關(guān)系

【摘要】 目的 探討臨床標(biāo)本中葡萄球菌形成生物膜的狀況，研究有無(wú)生物膜的葡萄球菌的耐藥性差異，幫助臨床根據(jù)藥敏結(jié)果選用抗菌藥物，及時(shí)有效控制葡萄球菌醫(yī)院感染。

方法 采用剛果紅，微量平板法檢測(cè)生物膜形成，觀察葡萄糖、乙醇、氯化鈉對(duì)生物膜形成的影響;對(duì)臨床標(biāo)本分離的葡萄球菌進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果 剛果紅法檢測(cè)腐生葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(金葡菌)﹑表皮葡萄球菌生物膜陽(yáng)性率分別為10.0%、16.7%、40.0%；生物膜半定量法：表皮葡萄球菌生物膜陽(yáng)性率TSB、TSB-0.25%Glu、TSB-2%Alc、TSB-4%Alc、TSB-2%NaCl、TSB-4%NaCl分別為13.5%、34.6%、33.3%、29.2%、19.4%、32.1%，其中0.25%Glu、TSB-2%Alc、TSB-4%NaCl為最佳濃度；藥敏結(jié)果，產(chǎn)生生物膜的葡萄球菌的耐藥性對(duì)青霉素、紅霉素和復(fù)方新諾明的耐藥有增加趨勢(shì)，耐藥率分別為：86.43%、82.44%、78.35%。結(jié)論 臨床標(biāo)本葡萄球菌絕大部分能產(chǎn)生生物膜、葡萄糖、乙醇、氯化鈉能促進(jìn)生物膜形成；葡萄球菌對(duì)臨床常用的抗菌藥物耐藥性嚴(yán)重，對(duì)其引起的感染可用萬(wàn)古霉素。

【關(guān)鍵詞】 葡萄球菌；生物膜；耐藥性；藥敏試驗(yàn)

文章編號(hào)：1003-1383(2008)03-0252-03 中圖分類號(hào)：R 378.110.446.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Analysis staphylococcal biofilm and relationship to its drug resistanted

Zhang Li ping1，LI Qing2，Guna1，Li Ling ling2，Tian gang2

(1.Laboratory of First Hospital，Kashi Xinjiang 844000，China;

2.Laboratory of Xinjiang ChineseMedical Hospital，Xinjiang 830000，China

3.Laboratory of Gong An Hospital，Tianjin，300042，China)

【Abstract】 Objective To study the formation of staphylococcal biofilm and the difference of drug resistance between Staphylococcus with or without biofilm，helping to choose the antibiotic according to the drug sensitive trial，controlling the staphylococcal inffectin effectivly and timely.

Methods Biofilm-forming ability was determined by congo red agar (CAR) and a semi-quantitative microtiter assay using trypticase soy broth .Glucose，alcohol and Nacl were added to the medium separately to test their effect on biofilm formation by staphylococcal isolates.Results Biofilm formation was positive by 10.0% to Staphylococcus saprophyticus，16.7% to Staphylococcus Aureus， 40% to Staphylococcus epidermidis by congo red agar. The positive rate of biofilm-forming by Staphylococcus epidermidis in TSB， TSB-0.25% glucose， TSB-2% alcohol， TSB-4% alcohol， TSB-2% NaCl and TSB-4% NaCl were 13.5%、34.6%、33.3%、29.2%、19.4% and 32.1%respectively. drug sensitivity results shown that more and moreStaphylococcus with biofilm had drug resistance to Penicillin， Erythromycin and sulfamethoxazole compound， resistance rate were 86.43%、82.43%、78.35% respectively.Staphyloccus collected from hospital were identified and drug resistanted. Conclusion Certain proportion of staphylococcal clinical isolates could form biofilm. Glucose， alcohol and NaCl can facilitate biofilm formation by Staphylococcus. The Staphylococcus had strong resistance to antibiotics. vancomycin can be used.

【Key words】 Staphylococcus;Biofilm;Resistance

葡萄球菌（stahylococcus ）很容易在插管和其它異物表面黏附，形成細(xì)菌生物膜。生物膜可保護(hù)細(xì)菌不受抗菌藥物的作用，并降低機(jī)體免疫功能和細(xì)胞吞噬功能，致使感染難以治愈。細(xì)菌一旦形成生物膜會(huì)造成細(xì)菌表面抗原位點(diǎn)被覆蓋和抗生素不容易穿入等后果，因而表現(xiàn)為耐藥等特點(diǎn)［1～2］。近十余年來(lái)葡萄球菌已被認(rèn)為是一種主要的醫(yī)院感染的條件致病菌。為了了解葡萄球菌形成生物膜的狀況及影響因素，我們用剛果紅和半定量微量平板法對(duì)葡萄球菌進(jìn)行生物膜定性定量分析和藥敏試驗(yàn)，了解葡萄糖［3］、乙醇、氯化鈉等因素對(duì)生物膜形成的影響及葡萄球菌生物膜與耐藥性的關(guān)系，尤其對(duì)產(chǎn)生生物膜的葡萄球菌和沒(méi)有產(chǎn)生生物膜的葡萄球菌耐藥性進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1.材料

（1）菌株 收集本院住院及門診病人的尿、痰、分泌物和傷口等標(biāo)本中葡萄球菌有90株，有60株是血漿凝固酶陰性葡萄球菌（CNS），其余 30株為金葡菌。ATCC-25922株為ATCC的標(biāo)準(zhǔn)菌株，經(jīng)鑒定為低生物被膜形成的葡萄球菌。

（2）培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基為胰酪胨大豆肉湯（TSB杭州天和微生物試劑有限公司），腦心浸液瓊脂（OXOID產(chǎn)品）；葡萄糖（Glu）、蔗糖、氯化鈉（NaCl）、無(wú)水乙醇（Alc）、剛果紅、蕃紅花T均為國(guó)產(chǎn)分析物。96孔板酶標(biāo)儀?？股丶埰ueller-Hinton(M-H)培養(yǎng)基（OXOID產(chǎn)品），除特別說(shuō)明外所有細(xì)菌培養(yǎng)均在37℃有氧條件下培養(yǎng)。

2.方法

（1）生物膜定性 用選擇血平板分離單個(gè)菌落接種于剛果紅培養(yǎng)基上（剛果紅0.8 g/L，腦心浸液干粉47 g/L，蔗糖36 g/L），37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，再在室溫放置24小時(shí)，金葡菌置72小時(shí)。產(chǎn)生生物膜的菌落變?yōu)楹谏?，不產(chǎn)生生物膜的菌落仍為紅色。

（2）生物膜半定量 ①不同條件下生物膜生長(zhǎng)情況的觀察：從血平板分離的單個(gè)菌落接種于5 mlTSB、調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠞舛龋謩e用TSB、TSB-0.25%Glu、TSB-2%NaCl、TSB-4%NaCl、TSB-2%Alc、TSb-4% Alc37℃培養(yǎng)12小時(shí)。觀察哪項(xiàng)為最佳培養(yǎng)濃度。

②半定量測(cè)定：分別用TSB、TSB-0.25%Glu、TSB-2%NaCl、TSB-4%NaCl、TSB-2%Alc、TSB-4% Alc 1∶100稀釋后，加入96孔板，每孔200 μl，每株菌6個(gè)平行孔，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，使用蒸餾水洗板三次，加入0.1%蕃紅花T染液200 μl染1 min，再用蒸餾水洗板三次，加入蒸餾水200 μl，用酶標(biāo)儀490 nm比色，讀取數(shù)值。每個(gè)96孔板包括空白對(duì)照（單純TSB）、陰性對(duì)照。選剛果紅培養(yǎng)陰性，半定量培養(yǎng)20次均與空白對(duì)照吸光度值相近，為陰性對(duì)照株。

（3）藥敏試驗(yàn)采用Kirby-Bauer瓊脂擴(kuò)散法 按美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS2000年版）判斷標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控要求進(jìn)行操作和判讀結(jié)果?？咕幟艏埰校罕竭蛭髁帧⑶嗝顾亍?fù)方新諾明、紅霉素、克林霉素、萬(wàn)古霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、四環(huán)素、替考拉寧、阿莫西林/克拉維酸。

（4）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用卡方檢驗(yàn)和方差分析對(duì)兩組生物膜陽(yáng)性率及吸光度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

結(jié)果

1.生物膜定性檢測(cè)結(jié)果 30株金葡菌中5株產(chǎn)生生物膜，陽(yáng)性率為16.7%；30株表皮葡萄球菌中有 12株產(chǎn)生生物膜，陽(yáng)性率為40.0%；30株腐生葡萄球菌中有3株菌產(chǎn)生生物膜，陽(yáng)性率為10.0%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩組陽(yáng)性率的結(jié)果比較都有顯著性差異(P＜0.05)，表皮葡萄球菌的陽(yáng)性率最高，其次為金黃色葡萄球菌，最后為腐生葡萄球菌。(見(jiàn)表1和表2)

2.生物膜半定量檢測(cè)結(jié)果 陽(yáng)性株篩選條件為：陰性對(duì)照平均值±3倍標(biāo)準(zhǔn)差（陰性對(duì)照為0.1±0.05），陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)＞0.3，表皮葡萄球菌生物膜陽(yáng)性率TSB、TSB-0.25%Glu、TSB-2%Alc、TSB-4%Alc、TSB-2%NaCl和TSB-4%NaCl分別為13.5%、34.6%、33.3%、29.2%、19.4%和32.1%；表皮葡萄球菌組中0.25%Glu、TSB-2%Alc、TSB-4%NaCl生物膜形成率高于TSB（P＜0.05）；且它還高于TSB-2%NaCl（P＜0.05）；其它各組間均無(wú)差異。這表明TSB-0.25%Glu、TSB-2%Alc、TSB-4%NaCl為培養(yǎng)基的最佳組成成分，做半定量就可用此濃度的配比。表皮葡萄球菌的平均OD為0.3，其陽(yáng)性率為29%；腐生葡萄球菌的平均OD值為0.15，其陽(yáng)性率為12%；金色葡萄球菌的平均OD值為0.12，其陽(yáng)性率為8%。由此可見(jiàn)，表皮葡萄球菌生物膜產(chǎn)生率明顯高于其它兩組。

3.藥敏結(jié)果 產(chǎn)生生物膜的葡萄球菌對(duì)青霉素、紅霉素和復(fù)方新諾明耐藥最為嚴(yán)重，其耐藥率可達(dá)86.43%、82.44%、78.35%；對(duì)苯唑西林、環(huán)丙沙星、克林霉素、慶大霉素的耐藥率分別為68.56%、57.03%、51.05%、42.47%；其它像替考拉寧、阿莫西林較為敏感，未發(fā)現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素的菌株。無(wú)生物膜的葡萄球菌對(duì)青霉素類、喹諾酮類抗生素和β-內(nèi)酰胺類的耐藥率也達(dá)50%以上，但有生物膜的葡萄球菌對(duì)抗生素的耐藥情況比無(wú)生物膜的葡萄球菌更為嚴(yán)重。

討論

近年來(lái)葡萄球菌的臨床感染率不斷上升，其主要原因在于它黏附在臨床常用的多聚材料上，并形成生物膜，生物膜使葡萄球菌呈現(xiàn)慢性、持續(xù)性和反復(fù)性等生長(zhǎng)特點(diǎn)，它可保護(hù)細(xì)菌不受抗菌藥物的作用，并降低機(jī)體免疫功能和細(xì)胞吞噬功能，致使感染難以治愈。

葡萄球菌生物膜中存在多種主要的生物大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA、肽聚糖脂、磷脂等物質(zhì)。生物膜這種多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程。因此，生物膜形成機(jī)制的研究已成為抗葡萄球菌感染的中心問(wèn)題。本文對(duì)葡萄球菌生物膜形成選擇的最佳培養(yǎng)基配方研究發(fā)現(xiàn)：0.25%葡萄糖、2%無(wú)水乙醇、4%氯化鈉為最佳培基濃度，生物膜在此條件下形成明顯，可能是與氯化鈉濃度的選擇有關(guān)。本文選擇了0.25%葡萄糖、TSB-2%Alc、TSB-4%Alc、TSB-2%NaCl、TSB-4%NaCl這幾種不同濃度培養(yǎng)葡萄球菌，從生物膜半定量檢測(cè)的結(jié)果看，0.25%Glu、TSB-2%Alc、TSB-4%NaCl對(duì)生物膜的形成有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。由此可見(jiàn)，作為條件致病菌的葡萄菌生物膜形成與培養(yǎng)基成分密切相關(guān)。不同的培養(yǎng)基成分有不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。如0.25%Glu可誘導(dǎo)icaABCD表達(dá)，ica基因編碼參與是PIA合成的糖基轉(zhuǎn)移酶，ica基因是典型的原核操作子的結(jié)構(gòu)，ica操縱子包括調(diào)節(jié)基因icaA和結(jié)構(gòu)基因icaADBC。低生物膜形成的葡萄球菌主要由于icaA基因缺失。葡萄糖對(duì)生物膜的誘導(dǎo)作用主要是通過(guò)誘導(dǎo)ica基因的表達(dá)和多糖PIA 的合成而起作用的。2%Alc和4%NaCl可抑制icaR表達(dá)，激活SigB和RsbU因子，從而誘導(dǎo)生物膜形成。本文以表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和腐生葡萄球菌這三類菌株為對(duì)象，采用生物膜定性及半定量實(shí)驗(yàn)方法。通過(guò)研究不同成分的培養(yǎng)基對(duì)生物膜形成的影響，得出結(jié)論為臨床標(biāo)本葡萄球菌相當(dāng)一部分可產(chǎn)生生物膜，其中0.25%Glu、0.2%Alc和4%NaCl能促使生物膜的形成，陽(yáng)性率從強(qiáng)至弱依次為表皮葡萄球菌為29%、金葡菌為12%、腐生葡萄球菌為8%。

葡萄球菌生物膜形成與否和耐藥性有密切的關(guān)系。本文選用12種抗菌藥物對(duì)兩組有無(wú)生物膜的葡萄球菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示：產(chǎn)生生物膜的葡萄球菌對(duì)青霉素、紅霉素和復(fù)方新諾明類抗生素耐藥，且耐藥率高達(dá)80%以上，對(duì)苯唑西林、環(huán)丙沙星、克林霉素、慶大霉素的耐藥率分別為68.56%、57.03%、51.05%、42.47%，對(duì)其它像替考拉寧、阿莫西林較為敏感。但未發(fā)現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素的菌株［5］。沒(méi)有生物膜的葡萄球菌，對(duì)青霉素類、喹諾酮類抗生素和β-內(nèi)酰胺類的耐藥率也達(dá)50%以上，但前者對(duì)抗生素的耐藥情況比后者的更為嚴(yán)重。由此可見(jiàn)，葡萄球菌對(duì)喹諾酮類抗生素如環(huán)丙沙星、β-內(nèi)酰胺類抗生素如苯唑西林、克林霉素，還有青霉素類等抗菌藥物已高度耐藥，這些不宜作為臨床經(jīng)驗(yàn)用藥。單一抗生素也許效果并不佳，還應(yīng)該幾種抗生素聯(lián)合使用，以起到最佳抑菌效果。

本研究建議在臨床治療和細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中，應(yīng)先將葡萄球菌屬嚴(yán)格區(qū)分為有生物膜和無(wú)生物膜的葡萄球菌，有利于對(duì)葡萄球菌耐藥性的正確分析和抗菌藥物的選擇，避免抗菌藥物的濫用，保護(hù)有限的抗生素資源。此外，還要從細(xì)菌生物膜中鑒定新的抗生素物質(zhì)，發(fā)展新型抗生素類藥物；預(yù)防生物膜污染各種臨床應(yīng)用的導(dǎo)管、插管和醫(yī)用合成材料，表皮鐸銀的合成材料可預(yù)防生物膜污染心臟人工瓣膜和導(dǎo)管等。目前應(yīng)用的抗生素主要是通過(guò)測(cè)定其殺菌或抑菌活性篩選獲得的，但有必要應(yīng)用新的篩選標(biāo)準(zhǔn)，如抗細(xì)菌黏附等，重新判定已知抗生素的抗生物膜的活性。

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(收稿日期：2008-03-21 修回日期：2008-05-26）

(編輯：潘明志 英文審校：鐘京梓)