中藥抗癌靈對(duì)肝癌ＳＭＭＣ７７２１細(xì)胞增殖的影響

【摘要】 目的 觀察中藥抗癌靈（Kangailing， Ka）對(duì)人肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖的影響并探討其可能分子機(jī)制。方法 提取、配制不同抗癌靈生藥濃度，作用于體外培養(yǎng)的人肝癌SMMC7721細(xì)胞，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞儀法檢測凋亡率，二步法免疫組化檢測野生型P53、NFкB P65和Bcl2蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，Ka各濃度組細(xì)胞抑制率顯著上升（P＜0.001），細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01或P＜0.001），P53蛋白表達(dá)顯著上升（P＜0.001），NFкB和Bcl2蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.001）。結(jié)論 Ka通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖，其分子機(jī)制可能與上調(diào)野生型P53蛋白表達(dá)，下調(diào)NFкB P65和Bcl2蛋白表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 中藥；抗癌靈；肝癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；基因表達(dá)

文章編號(hào)：1003-1383(2008)04-0381-03中圖分類號(hào)：R 735.7；Q 253 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Efects of Traditional Chinese Medicine Kangailing on Proliferation of Human Liver Cancer SMMC7721 Cells

WEI Pengya1，PU Hongqin2，WEI Xing3，LI Chaogan3，NONG Song3

(1.Department of Microbiology，Youjiang Medical College for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China;2.Department of Anatomy，Youjiang Medical College for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China;3.Department of Biochemistry and Molecular Biology， Youjiang Medical College forNationalities，Guangxi Baise 533000，China)

【Abstract】 Objective To observe the effects of traditional Chinese medicine Kangailing on proliferation in human hepatoma SMMC7721 cell lines in vitro and investigate its possible molecular mechanism.

Methods The proliferation inhibitory rate was evaluated by MTT assay. Apoptotic rate was determined by flow cytometry. The expression of wild type P53，NFкB P65and Bcl2 proteins were detected by twostep immunhistochemical staining.Results The cell inhibitory rate and apoptotic rate and the expression of P53 Protein of Ka treatment groups increased obviously than that of control group (P＜0.001)， while NFкB P65and Bcl2 Proteins were decreased markedly(P＜0.001). Conclusion Kangailing could inhibit the proliferation of SMMC7721 cells in vitro by inducing cancer cell apoptosis， and its molecular mechanism may be associated with the upregulation ofthe expression of wild type P53 protein and downregulation of the expression of NFкB P65and Bcl2 proteins.

【Key words】 traditional Chinese medicine;Kangailing;liver cancer;proliferation;apoptosis;gene expression.

腫瘤不僅是細(xì)胞增殖和分化異常的疾病，也是細(xì)胞凋亡異常的疾病。越來越多證據(jù)表明，中藥抗癌的療效與中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。許多天然藥物可以通過干擾腫瘤細(xì)胞生長、代謝和增殖等過程，最終誘導(dǎo)觸發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用［1，2］。復(fù)方中藥抗癌靈(Kangailing，Ka)由白英、白花蛇舌草、半枝蓮和半邊蓮等中草藥組成，具有清熱解毒、活血化瘀等功效。臨床上該復(fù)方廣泛應(yīng)用于各種癌癥的治療，尤其對(duì)肝癌、肺癌、胃癌及鼻咽癌等有較好的療效。本研究通過觀察中藥Ka對(duì)人肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖作用的影響，旨在探討其分子作用機(jī)制，為該復(fù)方中藥應(yīng)用于肝癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1.材料 人肝癌SMMC7721細(xì)胞株由中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫提供，胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）為上海普飛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，碘化丙啶(propidium iodide，PI)為Sigma公司產(chǎn)品，鼠抗人NFкB P65、野生型P53和Bcl2單克隆抗體為Santa cruz公司產(chǎn)品，PowerVisionTM免疫組化檢測試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。KHBLabsystems K3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司），BX51型顯微鏡（OLYMPUS，日本），流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，USA) 。

2.方法

（1）藥物提取 取復(fù)方中藥抗癌靈(購買于百色市中醫(yī)院中藥房)干品100 g，用1000 ml水浸泡1 h，加熱煮沸后小火煎熬60 min，室溫冷卻，120目網(wǎng)篩過濾，棄藥渣，濾液離心(3 000 r/min×20 min×2次)。取上清液，濃縮至50 ml，調(diào)pH值為7.0～7.2，0.22 μm過濾除菌，獲生藥含量為2.0 g/ml 的Ka水提液，5 ml/瓶分裝，-20℃保存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)時(shí)將含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至所需的藥物濃度。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 體外培養(yǎng)人肝癌SMMC7721細(xì)胞，以含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)增殖期，取生長良好的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（不加藥物處理）和Ka組（濃度分別為10、20、40 ml/L）。藥物作用時(shí)間均為24 h。

（3）細(xì)胞抑制試驗(yàn)(MTT法) 將對(duì)數(shù)生長期的SMMC7721細(xì)胞移入96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度約為1×10⁴個(gè)/ ml，每孔加入200 μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h。吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加入含抗癌靈提取液的10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液200 μl，每個(gè)藥物濃度設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔。培養(yǎng)到20 h，每孔加入MTT（5 mg/ml）20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 150 μl，用震蕩混合儀震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。選擇492 nm波長酶標(biāo)儀測定每孔光吸收值（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。按下列公式計(jì)算抑制率：抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

（4）流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 藥物作用24 h后，收集各組細(xì)胞約2×10⁵個(gè)，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液；PBS沖洗兩次，加入70%預(yù)冷的乙醇固定，4℃，1～24 h；離心棄去固定液，PBS沖洗去乙醇；PBS重懸細(xì)胞，400目篩網(wǎng)過濾1次，離心棄去PBS；加入RNase A (終濃度為60 μg/ml)，搖勻，37℃溫育30 min，加入PI(終濃度為50 μg/ml)， 4℃避光30 min；流式細(xì)胞儀檢測，每份標(biāo)本測定(2～4)×103個(gè)細(xì)胞，采用Modifit Lt軟件分析。

（5）免疫組化法檢測基因蛋白表達(dá) 按照二步法免疫組化檢測試劑盒說明書操作：藥物處理細(xì)胞24 h后，收集各組細(xì)胞，PBS沖洗兩次，制成細(xì)胞懸液涂片，風(fēng)干后丙酮固定15 min；3%過氧化氫孵育5 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；滴加一抗（稀釋1∶100），室溫90 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴加IgG抗體HRP多聚體20～30 min，PBS沖洗，5 min×3次；用DAB溶液顯色；蒸餾水沖洗、蘇木素襯染、脫水、封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果分析：P53蛋白定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核染為棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞；NFκB和Bcl2蛋白定位于細(xì)胞漿，細(xì)胞漿染為棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。利用CMLAS彩色病理圖像分析系統(tǒng)（北京航空大學(xué)空軍總醫(yī)院研制）進(jìn)行分析。隨機(jī)計(jì)數(shù)低倍鏡下10個(gè)視野中的陽性細(xì)胞占該視野細(xì)胞總數(shù)的比率，得出每組細(xì)胞的陽性率。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.各組SMMC7721細(xì)胞抑制率和凋亡率的比較 Ka各濃度組的細(xì)胞抑制率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組（P＜0.01或P＜0.001）。表1。

2.各組SMMC7721細(xì)胞基因蛋白表達(dá)的比較 與對(duì)照組比較，Ka各濃度組細(xì)胞的P53蛋白表達(dá)明顯上升（P＜0.001），NFκB和Bcl2蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.001）。見表2。

討論

白英、白花蛇舌草、半枝蓮、半邊蓮、莪術(shù)等屬于傳統(tǒng)的抗腫瘤中草藥，從中藥藥理功能分析，又具有清熱解毒、活血化瘀、利水除濕及破癥攻毒之功效。本實(shí)驗(yàn)用MTT法檢測中藥復(fù)方Ka提取液對(duì)人肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示，Ka對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷能力；流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，SMMC7721細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度增高而明顯上升。提示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是Ka提取液抑制SMMC7721細(xì)胞增殖機(jī)制之一。

凋亡細(xì)胞是多種基因互相作用、綜合調(diào)節(jié)的結(jié)果［3］。大量的研究證實(shí)：野生型P53是一種抑癌基因，能夠在各種條件下引導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl2是一種調(diào)控死亡的“存活基因”，是一種廣義的抑制凋亡基因，Bcl2高表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，多種化療藥物及中藥的抗腫瘤活性均與Bcl2基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)［4］。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，Ka誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡與上調(diào)P53和下調(diào)Bcl2基因蛋白表達(dá)有關(guān)。

NFκB（nuclear factorkappa B，NFκB）是細(xì)胞內(nèi)一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，近年來的研究顯示，NFκB在腫瘤的抗凋亡機(jī)制中起重要作用。目前，NFκB主要通過以下三條途徑來抑制細(xì)胞凋亡［5］：①NFκB通過調(diào)控細(xì)胞因子而參與自身及其它細(xì)胞凋亡。②NFκB通過誘導(dǎo)或上調(diào)凋亡抑制基因抑制細(xì)胞凋亡。③NFκB通過誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptorassociated factor，TRAF)和凋亡抑制蛋白IAP抑制細(xì)胞凋亡。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，Ka提取液可能通過抑制NFκB基因的表達(dá)，達(dá)到下調(diào)其它凋亡抑制基因或因子，以及解除其對(duì)促凋亡基因或因子的抑制作用，從而促使SMMC7721細(xì)胞凋亡。

總之， Ka通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖，其分子機(jī)制可能與上調(diào)野生型P53蛋白表達(dá)，下調(diào)NFкB P65和Bcl2蛋白表達(dá)有關(guān)，但其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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［5］朱 波.核轉(zhuǎn)錄因子κB與細(xì)胞凋亡［J］.國外醫(yī)學(xué)#8226;臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2001，22(1):18-19.

(收稿日期：2008-05-20 修回日期：2008-07-16)

(編輯：梁明佩 英文審校：鐘京梓)