基于種間漸滲的甜瓜屬野生優(yōu)異基因發(fā)掘研究

摘要：作物近緣野生種中含有諸多栽培作物中所迫切需要的優(yōu)異基因，通過種間雜交發(fā)掘利用這些基因是作物遺傳改良的重要途徑。本文回顧了栽培黃瓜種間雜交研究相關(guān)歷史背景，介紹了近年來特異資源創(chuàng)制取得的進(jìn)展，著重闡述了基于種間漸滲途經(jīng)發(fā)掘野生優(yōu)異基因所涉及的科學(xué)問題和方法，展望了對黃瓜基因組研究和品種改良的巨大前景。本文對葫蘆科其他作物基因發(fā)掘具有重要的借鑒和指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：甜瓜屬；黃瓜；種間雜交；基因發(fā)掘

1 黃瓜種間雜交研究相關(guān)背景及進(jìn)展

1.1研究背景

黃瓜(Cucumis sativus L.，2n=14)是一種世界性的重要蔬菜。原產(chǎn)溫暖濕潤的喜馬拉雅山南麓的印度北部地區(qū)。根據(jù)其地理分布、食用類型(鮮食或加工)和形態(tài)學(xué)特征(果實(shí)大小、長度、直徑、顏色、果皮厚度及果瘤等)。一般可分為華南型、華北型、歐洲溫室型(包括長、短2種)、歐美切片型、腌制加工型等。日本黃瓜來源于華北型和華南型雜交，韓國黃瓜接近華南型。

黃瓜在甜瓜屬(Cucumis)的系統(tǒng)分類地位非常特殊。在現(xiàn)行分類系統(tǒng)下，甜瓜屬由黃瓜亞屬(Subgen.Cucumis)和甜瓜亞屬(Subgen.Melo)組成，甜瓜亞屬中有29個物種，而黃瓜亞屬中只有栽培黃瓜1個物種。這個分類系統(tǒng)的依據(jù)是染色體基數(shù)和地理起源。在這種系統(tǒng)關(guān)系背景下，栽培黃瓜表現(xiàn)出2個突出的問題，一是遺傳基礎(chǔ)狹窄，并且由于其相對獨(dú)立的系統(tǒng)關(guān)系，難以進(jìn)行種間雜交；二是黃瓜資源內(nèi)缺乏重要的抗病基因，生產(chǎn)上病害發(fā)生非常嚴(yán)重。正是因?yàn)檫@2個問題的存在，長期以來，使得基于種內(nèi)變異的黃瓜遺傳育種難以獲得重大突破。甜瓜屬野生種中存在多種抗病基因，歷史上曾有不少學(xué)者嘗試過種間雜交，但都沒有獲得成功。要使黃瓜育種有所突破，必須打破種間界限，充分利用野生資源所蘊(yùn)藏的獨(dú)特性狀。

筆者1989年在我國云南省發(fā)現(xiàn)和采集到1個甜瓜屬珍稀野生種C.hystrix Chakr.。這個野生種在形態(tài)上與黃瓜比較一致，但染色體數(shù)上卻與甜瓜相同。通過同工酶分析發(fā)現(xiàn)，盡管這個野生種與栽培黃瓜具有不同數(shù)目的染色體，但兩者卻有相對較近的親緣關(guān)系。正是這種特殊親緣關(guān)系使筆者找到了黃瓜種間雜交的突破口，實(shí)現(xiàn)了這個具有歷史意義的種間雜交。由于種間雜交F₁代植株具有單數(shù)染色體(2n=19)。沒有育性，筆者就對染色體進(jìn)行了加倍，獲得2n=38的異源四倍體(Allotetraploid)植株，也被稱為新物種，從而恢復(fù)了育性。

1.2國際評價

我們獲得的是栽培黃瓜第1個成功的種間雜交。引起了國內(nèi)外甜瓜屬遺傳育種各方面的關(guān)注。報道這一成果的文章在美國《HortSciece》上作為“特寫論文”加封面發(fā)表。著名葫蘆科遺傳育種專家、美國康奈爾大學(xué)Dr.Richard Robinson教授的評價是：這是一項出色的研究。他代表了在甜瓜屬植物系統(tǒng)分類和系統(tǒng)發(fā)育研究上一個極為重要的進(jìn)步。對黃瓜和甜瓜育種、遺傳以及生理學(xué)研究具有根本性的重要性。著名葫蘆科系統(tǒng)分類學(xué)家、美國農(nóng)業(yè)部Dr.Joseph Kirkbride的評價是：這項研究具有相當(dāng)?shù)闹匾浴Ｊ怯惺芬詠淼?個成功的有黃瓜參與的種間雜種。并且還是第1個在甜瓜屬報道的、在染色體2n=14和2n=24之間的雜種。美國威斯康星大學(xué)農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)院院長Dr.Molly Jahn教授的評價是：這個種間雜交可以改變世界黃瓜的遺傳育種。2000年8月17日。美國華爾街日報也對這項研究進(jìn)行了報道。報道的題目是“小黃瓜-甜瓜雜交為科學(xué)研究創(chuàng)造了1個新物種”。文章特別指出：這個新物種可被用作橋梁。目標(biāo)是將野生種中有價值的性狀轉(zhuǎn)移到商業(yè)化生產(chǎn)的甜瓜和黃瓜中。

1.3主要進(jìn)展

自2000年以來，我們在不斷選擇獲得育性穩(wěn)定的異源四倍體的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了一系列特異資源材料創(chuàng)制研究。我們的這些研究連續(xù)獲得國家自然基金面上項目支持，并取得了重要進(jìn)展。首先我們將創(chuàng)制的異源四倍體新物種與栽培黃瓜回交獲得了異源三倍體(Allotriploid)，具有26條染色體。我們繼續(xù)將這個三倍體和二倍體雜交，獲得了單體異附加系(Monosomic addition line)，就是在黃瓜基因組中添加1條野生種染色體，15條染色體。在來源于種間雜交的后代中篩選獲得一系列含有野生種染色體片斷的異源易位系(Alien translocation line)。同時我們還鑒定出上百份含有野生種DNA的漸滲系(Introgression line)。

近年來我們圍繞本項研究在國內(nèi)外重要專業(yè)學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表的論文逾120篇。其中包括SCI收錄論文25篇，成果“甜瓜屬種間雜交的遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新”獲得2005年“教育部提名國家科學(xué)技術(shù)獎自然科學(xué)獎二等獎”。同時，我們還獲得幾項授權(quán)專利和品種權(quán)。

2 基于種間漸滲的野生優(yōu)異基因發(fā)掘

2.1科學(xué)問題

我們知道，野生優(yōu)異基因發(fā)掘是21世紀(jì)農(nóng)業(yè)研究的重要領(lǐng)域，而種間漸滲系是研究野生優(yōu)異基因的遺傳、定位和克隆的有效工具。這已在番茄、棉花等作物上得到很好的證實(shí)。這里實(shí)際上涉及到2個重要的科學(xué)問題。一是如何通過擴(kuò)大遺傳基礎(chǔ)(genetic base)來增加遺傳潛力(genetic poten-tial)，進(jìn)而提高生產(chǎn)力(productivity)；一是如何通過種間漸滲系篩選利用來有效地發(fā)掘利用野生種優(yōu)異基因。我們的種間雜交研究取得了突破性成功。已獲得系列特異染色體材料。包括種間漸滲系材料。這些材料的創(chuàng)制使我們能夠科學(xué)系統(tǒng)地研究野生優(yōu)異基因發(fā)掘。

2.2主攻目標(biāo)

我國黃瓜種質(zhì)資源的保護(hù)和利用取得了令世人矚目的成就。目前已入庫的黃瓜種質(zhì)資源約1494份，多于美國的1349份，居各類蔬菜的第8位。黃瓜種間雜交的成功為發(fā)掘利用野生優(yōu)異基因進(jìn)行遺傳改良開辟了途經(jīng)。近期將發(fā)掘利用的應(yīng)該是栽培黃瓜缺乏的重要抗病基因。這些基因的發(fā)掘，對黃瓜品種遺傳改良有極大的重要性，能夠顯著提高我國乃至世界黃瓜遺傳育種水平。

首先是根結(jié)線蟲。根結(jié)線蟲每年給全球農(nóng)業(yè)造成的損失高達(dá)1000億美元。目前危害黃瓜最重的是南方根結(jié)線蟲，在我國北方尤其是在設(shè)施栽培中發(fā)病非常嚴(yán)重。不少地方反映無法在大棚中栽培黃瓜。國內(nèi)外曾對數(shù)千份黃瓜資源進(jìn)行篩選鑒定，均未發(fā)現(xiàn)抗源。也就是說目前世界上沒有抗根結(jié)線蟲的黃瓜品種。

另外。蔓枯病目前在歐美十分嚴(yán)重，尤其是在設(shè)施栽培中發(fā)生普遍。在我國的發(fā)生也不斷增加。目前在可利用的黃瓜資源中也沒有發(fā)現(xiàn)有效的抗源。霜霉病是黃瓜傳統(tǒng)的三大病害之一。不論是設(shè)施栽培還是露地栽培均大面積發(fā)生。近年來出現(xiàn)的1個新問題是霜霉病病原發(fā)生了變異，產(chǎn)生新的生理小種，使得過去的抗病品種均普遍發(fā)病，引起了歐美國家高度重視。擁有上百家企業(yè)的國際腌制蔬菜集團(tuán)公司(Pickle Packer International，Inc.)的種子基金(Pickle Seed Research Funds)。今年將所有150萬美元研究經(jīng)費(fèi)都投向霜霉病研究。希望能夠盡早找到對付新霜霉病的對策。

2.3研究方法

基于種間漸滲的野生優(yōu)異基因發(fā)掘研究將主要包括3方面內(nèi)容。首先是漸滲系群體研究，分析漸滲DNA長度及漸滲到黃瓜基因組的野生種基因組數(shù)量和位置，鑒定出能夠最大限度覆蓋野生種基因組的漸滲系，篩選出含有優(yōu)異性狀的漸滲系。其次進(jìn)行漸滲圖譜構(gòu)建及抗病基因的精細(xì)定位。利用漸滲群體對抗病基因進(jìn)行初步定位，用篩選出的抗病漸滲系與感病黃瓜雜交構(gòu)建F₂代次級分離群體，構(gòu)建高密度分子遺傳圖譜，對抗病基因進(jìn)行精細(xì)定位。第3是基于圖譜和BAC文庫的抗病基因克隆，在野生種BAC文庫構(gòu)建及利用精細(xì)定位的標(biāo)記進(jìn)行陽性克隆篩選基礎(chǔ)上，構(gòu)建重疊克隆群及目標(biāo)基因區(qū)段的物理圖譜。鑒定出候選基因。進(jìn)行候選基因功能驗(yàn)證，分析候選基因與抗性的相關(guān)性。

3 黃瓜種間雜交突破性成功的重要意義及應(yīng)用前景

3.1重要意義

黃瓜種間雜交與其他多數(shù)種間雜交不同，具有明顯的特色和創(chuàng)新性。首先在方法上，主要是雙親染色體數(shù)目不同的種間漸滲群體的構(gòu)建。與其他多數(shù)種間雜交不同，黃瓜2n=14。野生種2n=24。種間雜種2n=19沒有育性，必須通過染色體加倍獲得異源四倍體(2n=38)后才能繼續(xù)與黃瓜回交，進(jìn)而獲得各種異染色體材料用于基因發(fā)掘。其次，通過種間雜交擴(kuò)大栽培黃瓜遺傳基礎(chǔ)。豐富變異類型，使黃瓜遺傳與品種改良能夠在種間變異基礎(chǔ)上進(jìn)行。第3，通過“黃瓜一野生種”種間漸滲途徑發(fā)掘甜瓜屬野生優(yōu)異基因，將把我國的種質(zhì)資源優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為基因資源優(yōu)勢，能夠形成一系列具有自主知識產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新性成果。

3.2應(yīng)用前景

品種改良：盡管“十五”期間我國黃瓜育種目標(biāo)向多樣化和專用化轉(zhuǎn)變，在繼續(xù)培育露地耐熱、春秋保護(hù)地品種的同時，加強(qiáng)了日光溫室越冬長季節(jié)、出口、加工等專用品種的選育阿，但由于育種材料親緣關(guān)系過分單一，1個親本在多個雜交一代品種中重復(fù)利用等，在種內(nèi)難以找到抗病、抗逆的有效資源，導(dǎo)致黃瓜栽培品種對各種生物和非生物脅迫的抗耐能力嚴(yán)重下降。為了從根本上解決黃瓜栽培種的遺傳基礎(chǔ)狹窄的困擾，挖掘野生抗性資源進(jìn)行黃瓜新品種改良已成為黃瓜遺傳育種的緊迫任務(wù)。

野生種C.hystrix中具有栽培黃瓜所急需的抗病抗逆基因，而且，這些優(yōu)異基因已經(jīng)部分轉(zhuǎn)導(dǎo)到其與栽培黃瓜的種間雜種后代中。如人工異源四倍體C.hytivus抗根結(jié)線蟲、維生素C含量高、異源易位系抗蔓枯病、病毒病、霜霉病、枯萎病以及耐低溫等。異源易位系與栽培黃瓜雜交親和，這就為人們提供了一個可以直接利用外源有用基因資源的途徑，利用優(yōu)異的漸滲系與美國威斯康星大學(xué)選育的雌性系黃瓜雜交，我們成功地培育出腌制加工黃瓜專用新品種寧佳1號叫。該雜種一代綜合了雙親的優(yōu)良性狀，產(chǎn)量高于雙親，且具有C.hytivus的耐低溫弱光、抗病性強(qiáng)等性狀，是國內(nèi)外率先利用種間變異進(jìn)行黃瓜品種改良的成功報道。

多倍體進(jìn)化：人工異源多倍體為植物多倍體演化研究提供了新模式，可望在基因組構(gòu)成和基因表達(dá)變化等基礎(chǔ)研究方面取得重要成果。我們的前期研究表明：新合成的人工異源多倍體在基因組序列、DNA片段甲基化水平及模式等方面都發(fā)生劇烈變化，表明早期世代的基因組經(jīng)歷著遺傳和表觀遺傳上的變化。

然而，要探明人工異源多倍體演化機(jī)理，必須系統(tǒng)地比較研究不同世代多倍體基因組的進(jìn)化性變化，包括：染色體改構(gòu)、特定基因的甲基化、逆轉(zhuǎn)座子激活等方面，即考察較高時代多倍體基因組的二倍體化機(jī)制。

此外，黃瓜-C.hystrix的異源易位系為研究黃瓜基因組的進(jìn)化提供了新途徑。作為典型的二倍體物種，黃瓜在染色體組的核型上屬于1A，按照Stebbins的觀點(diǎn)其染色體組的進(jìn)化已經(jīng)處于很高階段，人們很難對其染色體組(基因組)的進(jìn)化進(jìn)行分析研究。我們的前期研究表明：黃瓜異源易位系攜帶有野生種C.hystrix的染色質(zhì)，其C-分帶帶型(異染色質(zhì))的分布不同于原始親本黃瓜；而且，不同異源易位系中所漸滲的外源DNA片段也不同(周曉慧，待發(fā)表)。這些表明：異源易位系染色體組(基因組)正發(fā)生著明顯的結(jié)構(gòu)變化，這就為黃瓜基因組進(jìn)化研究提供了新機(jī)遇。