低溫乙醇法在人血白蛋白工業化生產中的應用

摘 要：人血漿中含有數量眾多的蛋白成分，如何把它們分離開來一直是個比較熱門的課題。二戰時期，哈佛大學的Cohn教授發明了低溫乙醇分離法后，血漿蛋白分離工業才得以蓬勃發展起來。本文將結合低溫乙醇法的基本原理以及筆者實際的工作經驗和體會，對人血白蛋白的工業化生產過程進行闡述。

關鍵詞：低溫乙醇法 人血白蛋白 工業化生產

人血漿中已經發現的蛋白成份約有100多種，其中已經分離提純和性質明了的有60余種，大約20種已經有臨床用途。血漿蛋白的分離，是利用不同蛋白成份的理化性質，如分子大小、密度高低、表面結構、荷電狀態等的區別，將其互相分開。

血漿蛋白分離工業在中國起步比較晚，直到上世紀80年代才真正開始了大規模的工業化生產，目前全國有30余家血制品生產企業，但其中大部分企業的主要產品僅有人血白蛋白和靜脈注射用人免疫球蛋白這2種血漿中含量最大的成份，可以說對血漿資源的利用率是比較低的。

血漿蛋白分離的方法很多，其中大部分方法只適用于實驗室研究使用，如電泳、等點聚焦等，可以應用于大規模生產的只有沉淀法（鹽析、有機溶劑法等）、層析法（凝膠層析、離子交換層析以及親和層析），另外的超濾、吸附、變性處理等均為輔助手段。目前，國內用于生產人血白蛋白和免疫球蛋白類制品的生產方法基本都是低溫乙醇法。筆者結合低溫乙醇法的基本原理以及本人實際的工作經驗和體會，對人血白蛋白的工業化生產過程進行闡述。

人血白蛋白是一個一級結構簡單的單鏈蛋白，無碳水化合物側鏈，僅含少量的脂肪酸，構型較為對稱，分子量約為69000D，由585個氨基酸殘基組成，富含門冬氨酸及谷氨酸，而缺乏色氨酸。天然狀態下，白蛋白含有19個負電荷，其i.e.p依溶液中含有的鹽的種類與濃度的不同在pH4.4~5.4之間。

低溫乙醇法的原理和要點為：往蛋白質的水溶液中加入乙醇，產生幾種效應，主要效應是降低水分子的活度，降低溶液的介電常數，從蛋白分子周圍排代水分子，使蛋白分子和蛋白分子之間通過極性基團的相互作用在范德華引力下發生凝聚，從而沉淀下來。影響這種沉淀過程的主要有5大參數：溶液的蛋白濃度、pH值、離子強度、溶液的溫度和乙醇的濃度。在前4個參數都一致的情況下，乙醇的沉淀作用取決于蛋白分子的大小。在逐漸提高乙醇濃度時，蛋白將按分子大小順序先后沉淀。人血白蛋白作為血漿主要成分中分子量最小的一種，是在最后一步的沉淀反應中分離出來的。下面是人血白蛋白生產的簡要工藝流程圖。（其中的部分主要參數進行了模糊化處理）

人血白蛋白制備工藝流程

步驟①：原料血漿的檢測。在現今血液傳播疾病越來越令人恐懼的情況下，對血漿進行常見的5種病毒檢測是國家的強制標準，而且必須是對每一袋單采血漿進行5項病毒檢測，合格后方可投入生產。

步驟②：8%乙醇沉淀反應，產生組份I沉淀，主要成分為纖維蛋白原。組份I沉淀可以用于人纖維蛋白粘合劑的生產。在此步驟之前一般會對原料血漿進行一次離心，可以分離得到冷沉淀，這也是制造凝血因子VIII的原料。離心去除冷沉淀之后的血漿可以用于人凝血酶原復合物（凝血因子II、VII、IX、X的混合物）的吸附生產。然后可以進行8%乙醇沉淀反應（若不生產凝血因子VIII和人凝血酶原復合物，也可以直接對原料血漿進行8%乙醇沉淀反應）。由于工業化生產中投入的血漿數量巨大（一般一次為5000千克血漿左右），反應罐的容積也是很大的，如我們公司使用的是5噸容量的罐。巨大的體積給乙醇濃度和pH值的調節帶來了一些問題。顯然我們不可能像在實驗室中那樣一邊加入緩沖液一邊攪拌，同時用pH計直接測試。實際采取的方法是：準確抽取10ml的溶液，滴定至指定的pH值，然后將所用的緩沖液量擴大到一個罐的反應液所需的量。一般情況下，需要加入的緩沖液量都會有數十千克，50%的乙醇大概會有500千克以上，往反應罐中加入這些液體的時候一定要控制好速度，加得太快會使局部pH值或酒精濃度超出限度而導致不良后果，加得太慢則會拖長生產周期。沉淀反應完成以后，需要將反應液靜置數小時，以利于沉淀的積聚（一般還會按一定的比例往反應液中加入硅藻土作為助濾劑），而后就可以進行分離，以收集沉淀，同時將上清液轉移入另外的反應罐以備進行下一步的沉淀反應。現今最常用的分離器具是壓濾機（以前也經常使用高速離心機來分離沉淀，但其使用成本和工人的勞動強度均比壓濾機要高，因此逐漸被壓濾法取代），它其實就是一臺大型的板框濾器，配合相應規格的濾板，反應液在壓縮空氣或泵的驅動下穿過濾器，沉淀被濾板截留在板框中，待液體過完后一并取出。每臺壓濾機大概可以容納400千克以上的沉淀。

步驟③：20%乙醇沉淀反應，分離出組份II+III沉淀，其主要成份為各種類型的球蛋白和凝血因子II、VII、IX、X。組份II+III沉淀可以用于免疫球蛋白類制品和人凝血酶原復合物的生產。上清液繼續進入下一步的反應。

步驟④：40%乙醇沉淀反應，分離出組份IV沉淀，主要成份為球蛋白、銅藍蛋白和一些補體蛋白，同時還含有少量的白蛋白。組份IV沉淀也可以用于回收分離白蛋白。上清液繼續進入下一步的反應。

步驟⑤：40%粗制反應，分離出組份V沉淀，也就是白蛋白，一般5000千克的血漿大約能得到600千克左右（具體的量和沉淀的干濕程度等都有關系）的組份V沉淀，其蛋白含量約為25%~28%。上清液中僅含少量的蛋白，直接棄去。此步驟分離出的白蛋白還不是很純，需要再進行一次純化反應。

步驟⑥：白蛋白純化反應。通過這個步驟得到的白蛋白溶液，其純度已經可以達到95%以上，但其中仍含有大量的乙醇和鹽類，需要通過超濾的方法將其去除。

步驟⑦：超濾脫醇及配制、滅活。這個步驟主要是去除蛋白溶液中的鹽類和乙醇，然后加入一定量的辛酸鈉，最后進行60℃10小時的巴氏滅活以確保人白制品的病毒安全性。血液制品在超過60年的使用歷史中，只有經過巴氏滅活的人血白蛋白才被公認為是安全制品。辛酸鈉在這里起的是保護劑的作用，一定濃度下可以幫助白蛋白忍受住60℃10小時的保溫過程，但如果辛酸鈉濃度過高，它也可能會保護病毒度過巴氏滅活。另外，如果是以組份IV沉淀為原料生產的白蛋白，由于其中含有較高濃度的PKA（激肽釋放酶原復合物，有降壓作用），在超濾脫醇前必須經過層析以去除大部分的PKA而保證制品的安全性。由于人血白蛋白為生物活性物質，無法承受劇烈的滅菌條件，所以，滅活完的蛋白溶液經過0.22微米的濾器過濾，就可以進行分裝，這也對前面的各生產步驟提出了較高的潔凈度要求。一般每5000千克血漿可以得到10克/瓶的人血白蛋白約12000支。

步驟⑧：最后的處理。分裝完畢后，制品還需要在30—32℃下放置14天，而后進行逐瓶燈檢，觀察其穩定性指標和外觀情況。同時取樣送檢測部門，待結果合格后才能投入銷售。

一批人血白蛋白從開始投料到可以銷售，大概需要一個半月到兩個月多的時間。

低溫乙醇法生產人血白蛋白已經是一個比較成熟的方法，現今的主要問題就是如何進一步提高人血白蛋白的得率，這主要牽涉到各步驟的一些細微注意點，也是我們的技術部門一直在追求的目標。

參考文獻：

［1］劉雋湘.輸血療法與血液制劑.1996年.

［2］中國生物制品規程.2000年版，1999年.

［3］《中華人民共和國藥典》三部.2005版，2005年.

［4］藥品生產驗證指南（2003）.2003.

［5］FDA，Biological Product Deviation Reports，Annual Summary for Fiscal Year， 2006.

［6］FDA，Biological Product Deviation Reports，Annual Summary for Fiscal Year， 2005.

［7］FDA，Biological Product Deviation Reports，Annual Summary for Fiscal Year， 2004.

［8］FDA，Biological Product Deviation Reports，Annual Summary for Fiscal Year， 2003.

［9］FDA，Biological Product Deviation Reports，Annual Summary for Fiscal Year， 2002.

［10］FDA，Biological Product Deviation Reports，Annual Summary for Fiscal Year， 2001.

［11］FDA，Biological Product Deviation Reports，Error and Accident Report FY1997 through FY2000.

［12］王清和等.中華血液制品學雜志.1983.

［13］王益壽.醫用生物制品學.1992.

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