辛伐他汀對缺血再灌損傷心肌細胞凋亡及ｂｃｌ－２／ｂａｘ基因蛋白的影響

摘 要 目的：辛伐他汀對缺血再灌心肌細胞凋亡及bcl-2/bax基因蛋白的影響。方法：20只大白兔隨機分為2組，辛伐他汀治療組(灌服辛伐他汀15mg/kg，每日1次，共7天)及對照組(灌服等量生理鹽水，每日1次，共7天)；采用結扎左冠狀動脈前降支30分鐘后再灌注120分鐘制備心肌缺血再灌模型；實驗結束前取心臟標本，進行細胞凋亡TUNEL法檢測以及免疫組化檢測心肌組織中bcl-2、bax蛋白水平。結果：①治療組心肌細胞凋亡指數(AI)明顯低于對照組(P<0.05)；②治療組心肌組織bcl-2蛋白明顯高于對照組(P<0.05)，bax蛋白明顯低于對照組(P<0.05)。結論：辛伐他汀可抑制細胞凋亡，減輕心肌損傷，其抑制凋亡可能是通過上調bcl-2蛋白表達和下調bax蛋白表達來實現的。

關鍵詞 辛伐他汀 心肌缺血再灌注 細胞凋亡

資料與方法

主要試劑和動物分組：TUNEL試劑盒購自美國、Ⅱ型膠原酶購自美國、bcl-2和bax試劑盒購自美國、辛伐他汀購自杭州。健康中國家兔20只，雌雄不限，單體質量(2.53±0.26)kg，隨機化分為治療組和對照組(每組10只)。治療組給予辛伐他汀15mg/kg，對照組予等量鹽水，術前7天灌服，每日1次，連續7天。

模型制備：所有大白兔均用1％戊巴比妥鈉30mg／kg靜脈麻醉，氣管插管，輔助通氣，用肝素充盈的普通膠管做右頸總動脈插管，經Mpa-0.5A換能器連接二道生理記錄儀（LMB-2B型，成都儀器廠）監測血壓，并以肢體I導聯同步監測心電圖。左側開胸，暴露心臟，切開心包，自冠狀動脈前降支（LAD）起點0.5cm處穿線（3～0絲線）環繞動脈。結扎線自一膠管腔內引出，結扎LAD，通過肉眼觀察及心電圖改變，判斷LAD結扎是否成功。LAD結扎30分鐘后松開，再灌注2小時。LAD結扎成功標準^[2]：心電圖顯示ST段抬高、QRS波變高變寬和缺血心肌變為青紫色。LAD再通成功標準：解開結扎線后QRS波幅逐漸回落、抬高的ST段回落和缺血區心肌變紅。

心肌組織切片制備：實驗結束后，將大白兔處死，取出心臟，用0.85%氯化鈉液沖洗，10%甲醛固定24小時。常規石蠟包埋，于心肌梗死區中部沿左室軸線每隔1mm連續切取數個5μm厚的切片，分別作蘇木精伊紅染色，并行細胞凋亡及bcl-2、bax基因蛋白表達檢測。

TUNEL法原位檢測心肌細胞凋亡：用PBS液作空白對照，用非免疫血清作陰性對照，具體操作步驟及結果檢測按試劑盒說明書進行。凋亡細胞半定量分析：在400倍高倍視野下，每張切片計數5個高倍視野，分別計算每個視野細胞核數及凋亡陽性細胞核數，取均值，根據Naru-la方法計算出凋亡指數(AI)：AI(%)=凋亡陽性的細胞核數/總計數的細胞核×100%。

免疫組化檢測心肌組織中bcl-2、bax蛋白表達:組織塊經10%多聚甲醛固定后，常規石蠟包埋，5μm厚連續切片，二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水后，按說明書操作，用SABC免疫組化法檢測bcl-2、bax蛋白的表達。光鏡下見陽性細胞質呈黃色或黃棕色，每個樣本隨機選10個視野作圖像分析，并用陽性積分光密度值/管壁面積計算統計值。陰性對照用PBS液代替抗bcl-2、bax抗體。

統計學分析所有的數據以均數±標準差（X±S）表示，采用11.5SPSS統計軟件，用t檢驗，P<0.05差異有統計學意義。

結 果

TUNEL染色：光鏡下凋亡的心肌細胞細胞核為深淺不一的棕褐色，細胞輪廓清楚;正常細胞核呈藍色，壞死區細胞結構模糊不清。TUNEL陽性細胞計數結果為：細胞凋亡指數(AI)在對照組為13.3863%±0.6426％，而治療組為5.2453%±0.5732％、兩組比較有統計學意義(P<0.05)。

免疫組化凋亡相關基因bcl-2、bax蛋白表達:與對照組比較，治療組心肌細胞bax蛋白表達光密度值明顯下降(P<0.05)，bcl-2蛋白表達光密度值明顯增高(P<0.05)(見表)。

討 論

他汀類藥物是近十幾年開發的三羥基三甲基戊二酰輔酶A(HMGCoA)還原酶抑制劑，多項大型臨床實驗已證實其對冠心病有一級和二級預防作用。大量證據表明，近年來，許多研究表明他汀類藥物在與降脂作用無關的情況下，不僅能減少缺血損傷，保護臟器功能，而且能通過改善內皮功能、抗炎、抑制血栓形成等途徑對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用^[1～3]。

從我們的實驗結果可以看出，辛伐他汀可以通過促進bcl-2基因的表達、減少bax基因表達來抑制心肌缺血再灌注所導致的心肌細胞的凋亡，進而減輕冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌梗死、心肌缺血再灌注等情況下的心肌損傷。

由此可見，辛伐他汀對心肌缺血再灌注損傷的確能起到保護作用，而且這種保護作用是通過多途徑實現的，為我們臨床應用提供了依據。

參考文獻

1 孫麗爽.他汀類藥物對缺血再灌注心肌的保護作用及機制.心血管病學進展，2007，28(2):229-232.

2 劉榮華，李海濤.辛伐他汀對心肌缺血再灌注損傷保護作用的機制研究概況.牡丹江醫學院學報，2007，28(1):58-60.

3 王國振，嚴玉平，朱長福.丹酚酸A辛伐他汀不同配比對大鼠心肌缺血再灌注性損傷的保護作用.河北中醫藥學報，2006，21(2):4-5.