寒富蘋果葉片離體再生及四倍體誘導

摘要：為建立寒富蘋果高效的離體再生體系和多倍體誘導體系，以試管苗葉片為外植體，研究了培養基中激素對寒富葉片再生芽的影響及適宜的四倍體誘導方法。結果表明，當培養基中BA質量濃度為0.5 mg/L時，再生頻率最高達35.7％；當培養基中BA質量濃度為2.5 mg/L時，再生頻率超過90％，平均再生芽數在4以上。在培養基中附加1.0mg/LTDZ，再生頻率達100％，平均再生芽數達19.47。以附加15、30、60、120 mg/C秋水仙素的液體再生培養基處理葉片5 d，各個質量濃度處理均誘導出四倍體植株，誘變率在5.3％～22.2％之間；寒富蘋果葉片在附加50 mg/L秋水仙素固體再生培養基上處理5 d亦獲得了四倍體植株。研究結果表明寒富蘋果葉片具有極強的不定芽再生能力，葉片再生過程中進行秋水仙素處理是獲得其四倍體的一個有效途徑。

關鍵詞：蘋果；葉片；離體再生；四倍體誘導

中圖分類號：S661.1 文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-293-05

多倍體是植物進化過程中的一種普遍現象，據統計大約有50％～80％的被子植物是多倍體。目前，全世界通過染色體鑒定的果樹多倍體類型分屬于20科，35屬，400余種。果樹多倍體一般具有生長旺盛、果實大且少子或無子、產量高、適應性和抗逆性強等特點，因此果樹多倍體育種多年來一直倍受育種者青睞。

近年來，在組織培養的基礎上結合秋水仙素等化學物質的處理成為獲得植物多倍體的一個重要途徑。目前，育種者們已經在柿(Diopyros Kaki)、棗(Zixyphus jujuba)、葡萄(Vitis vinifera)、梨(pyruspyrifolia)、山楂(Crataegus pinnatfida)、獼猴桃(Actinidia chinensis)、石榴(Punica granatum)、香蕉(Musa acuminata)和蘋果(Malis domestia)等多種果樹上成功地誘變出多倍體植株。蘋果的多倍體在自然界中早已存在，但自然突變產生四倍體的頻率很低，且一般是嵌合體狀態。國內外有關蘋果多倍體離體誘導的研究報道不多，而且在無性加倍的研究中，能夠誘導出多倍體的基因型較少。

寒富是沈陽農業大學育成的蘋果品種，具有抗寒、大果、豐產、穩產、優質和美觀等優點。寒富蘋果葉片再生及四倍體誘導的研究尚未見報道。我們在初步建立寒富蘋果葉片離體再生體系的基礎上，采用不同方式和不同濃度的秋水仙素誘導，以獲得寒富蘋果的四倍體植株，從而為蘋果的多倍體育種增添新的種質資源，如果再將其與現有四倍體品種和二倍體品種進行雜交，則可能會進一步獲得新的異源四倍體和三倍體資源。

1 材料和方法

1．1 材料

2005年春季，從沈陽農業大學果樹基地種植的寒富蘋果樹上剪取1 a生休眠枝條，然后于室內進行水培。待新梢發出后，去掉葉片，然后用體積分數70％酒精和0.1％HgCl₂溶液對嫩莖進行消毒。將消毒后的嫩莖剪成長1～1.5 cm的小段，接入MS+0.5mg/L BA+0.2 mg/L IAA+0.1 mg/L GA₃的固體培養基中。試管苗在相同的培養基上每隔30～50 d繼代1次。

1．2 不同激素組合對葉片離體再生影響

設計BA與IAA或NAA組合的再生培養基，激素的質量濃度分別為A₁-A₅：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L BA；B₁一B₂：0.2、0.5 mg/L IAA；B₃～B₄：0.2、0.5mg/LNAA。A與B完全組合，共20個處理。此外設計TDZ與NAA組合的培養基1種，即：1.0 mg/LTDZ+0.5 mg/L NAA。基本培養基為MS培養基，蔗糖含量3％，培養基用6 g/L瓊脂固化。

取繼代30 d的試管苗頂部展開葉片，剪去葉尖和葉柄部分，將中間部分剪成3-4mm寬的小條，然后分別接種在上述培養基上。采取隨機區組試驗設計，每處理3瓶，每瓶8個外植體，2次重復。

1．3 葉片離體誘導四倍體

從繼代30 d的試管苗頂部剪取展開葉片，將中間部分剪成3～4 mm寬的小條。然后分別用秋水仙素水溶液或含秋水仙素的再生培養基進行誘導處理。處理結束后將葉片接種在MS+1.0 mg/LTDZ+0.5 mg/L NAA+200 mg/L水解乳蛋白(LH)固體培養基上。再生出芽后轉到MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/LIAA+1.0 mg/L GA₃的培養基上，最后在MS+0.5mg/L BA+0.2 m∥L IAA+0.1 mg/L GA₃培養基上進行單芽繼代培養。

1．3．1 用秋水仙素水溶液進行誘導處理 將葉片外植體置于經抽濾滅菌的0.4％的秋水仙素水溶液中。以清水為對照，于(24+2)℃條件下在搖床上以90 r/min的速度震蕩培養4 d，共接種60個外植體。

1．3．2用含秋水仙素的再生培養基進行誘導處理(1)將葉片外植體分別置于附加15、30、60、120 mg/L經抽濾滅菌的秋水仙素的液體再生培養基(MS+1.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA+200 mg/L LH)中，靜置暗培養5 d；(2)將葉片外植體接種于MS+1.0 mg/LTDZ+0.5 mg/L NAA+200 mg/L LH+50 mg/L秋水仙素+1％二甲基亞砜的固體培養基(秋水仙素和二甲基亞砜皆為滅菌前加入)上，暗培養5 d或8 d。以上每個處理接種30個以上的外植體。

1．4 培養基制備和培養條件

所有培養的基本培養基均為含3％蔗糖的MS培養基。滅菌前將培養基的pH調整到5.8，然后分裝到100 mL三角瓶中，在121℃下滅菌20 min。

葉片外植體接種后首先進行2周的暗培養(包括秋水仙素處理期間的暗培養)，然后轉到光下培養，光周期14 h/d，光強約2 000 lx。培養室溫度(24+2)℃。

1．5 再生植株倍性的細胞學鑒定

上午9—11點取再生植株的莖尖，在20℃左右的黑暗條件下，置入飽和對二氯苯水溶液中浸泡5～6 h，然后在卡諾固定液中固定2～24 h，最后置于70％酒精中冷藏保存。用5 mol/L HCl解離軟化莖尖，以改良的卡保品紅染色并壓片，顯微鏡下觀察染色體數目，每個樣品觀察分裂好的細胞30個。

1．6 試管苗生根

剪取2-4 cm高的試管苗，首先接種到附加4.0mg/L IBA的MS培養基上暗培養4 d，然后轉到不加任何激素的1/2 MS中，在光下培養40 d。

1．7 數據處理及計算方法

葉片外植體在再生培養基上培養40 d后調查再生頻率和平均再生芽數，計算方法如下：

再生頻率(％)=出芽的外植體數/接種的外植體總數x100

平均再生芽數=再生芽總數/出芽外植體數

對再生植株進行細胞學倍性鑒定后調查誘變率：

誘變率(％)=四倍體數/鑒定植株總數x100

生根率(％)=生根株數/調查株數x100

平均生根數=生根總數/生根株數

顯著性分析用DPS軟件進行。

2 結果與分析

2．1 寒富蘋果葉片離體再生對細胞分裂素的敏感性

當培養基中附加0.5 mg/L BA時，寒富蘋果葉片具有一定的再生能力，最高再生頻率為37.5％，平均再生頻率為18.0％，平均每個葉片外植體再生出1.17個不定芽，可見寒富葉片對細胞分裂素非常敏感。

培養基中BA濃度為0.5-2.5 mg/L，寒富蘋果葉片的再生芽數隨著BA濃度的增加而增多，且再生頻率也大致隨著BA濃度的增加而增加(表1)。生長素中IAA對寒富蘋果再生不定芽的效果要好于NAA，2個濃度IAA的再生效果接近，低濃度NAA的再生效果好于高濃度NAA。綜合來看，2.5 mg/LBA與0.5 mg/L IAA組合的效果最好。

2．2 BA與TDZ對寒富蘋果葉片再生作用的比較

在MS+1.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA培養基上，寒富蘋果葉片的再生頻率可達100％，平均每個外植體的再生芽數達到19.47，表明用TDZ替代BA能夠明顯提高寒富蘋果葉片再生不定芽的效率。當培養基中附加BA時，寒富蘋果葉片再生出的芽呈單芽狀態，芽直立性好(圖版-A)，培養40 d以后即可剪下直接成苗，成苗快；當培養基中附加TDZ時，再生出的芽呈叢生狀，直立性差(圖版-B)，培養40d以后需將外植體轉到附加1.0 mg/L GA3的繼代培養基上繼續培養一段時間方能成苗，成苗慢。寒富蘋果葉片再生出的不定芽有不同程度的玻璃化現象，其中在附加TDZ的培養基上再生出的芽玻璃化程度比較嚴重。由于附加TDZ的培養基的再生芽數比附加BA的培養基高得多，因此，本研究在四倍體誘導的試驗中選用了附加TDZ的再生培養基。

2．3 寒富蘋果葉片離體誘導四倍體

寒富蘋果試管苗葉片在0.4％的秋水仙素水溶液中浸泡4 d后進行再生培養。在培養的第9天開始出現愈傷組織，以后愈傷組織逐漸增多，最后覆蓋整個葉片。但最終沒有再生出芽。

在附加秋水仙素的液體再生培養基處理5 d后，寒富蘋果試管苗葉片仍保持鮮綠(圖版C)。將其轉移到不含秋水仙素的固體再生培養基上培養1周后開始出現愈傷組織，在培養25 d時可以明顯地看到不定芽(圖版D)。隨著處理時秋水仙素濃度的增加，外植體的再生頻率逐漸降低(表2)，再生芽數也逐漸減少，但玻璃化程度也減輕(圖版E～H)。再生的不定芽在附加低濃度激素的成苗培養基(MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L IAA+1.0 mg/L GA₃)上培養40 d左右分化成苗。各個秋水仙素濃度的處理均有四倍體生成(表2)，以60 mg/L秋水仙素處理獲得的四倍體比率最高，誘變率高達22.2％。

對于在附加50 mg/L秋水仙素的固體培養基上暗培養5 d的誘導處理，葉片的再生頻率盡管不是很高(44.4％)，但是再生的不定芽質量較好。在鑒定的60個再生植株中有12株是四倍體(表2)，變異率達20.0％，與附加60 mg/L秋水仙素的液體培養基處理的誘變率(22.2％)接近。

通過細胞學觀察，可觀察到普通寒富的染色體數為2n=2x=34，變異體2n=2x=68，可以確立為四倍體(圖版-K，L)。本研究共獲得了寒富蘋果的四倍體植株20株。各株系在外觀形態上都表現出了生長緩慢、葉色濃綠、莖粗壯和節間短等典型的四倍體植株的生長特點，與普通二倍體相比具有明顯差異(圖版-I，J)。

2．4 試管苗生根

寒富蘋果的二倍體試管苗植株生根率(80.5％)遠遠高于四倍體試管苗植株的生根率(31.3％)，但是在平均生根數上，2種類型的植株沒有明顯差異(表3，圖版－M，N)。

3 討論

3．1 寒富蘋果葉片的再生能力

寒富蘋果離體葉片再生能力極強，附加低質量濃度BA(0.5 mg/L)即有不定芽的再生，在BA為2.5mg/L的條件下再生率即超過90％，而前人研究的再生力最強的嘎啦蘋果，在5.0 mg/L BA的條件下，再生率也只有90％左右。寒富具有極強的再生能力的特性也是本試驗四倍體誘導能夠獲得成功的一個主要原因，因為只有擁有較高的再生頻率，才有獲得較多四倍體植株的可能。再生能力可以克服外植體再生困難而導致的基因轉化頻率低的問題，寒富蘋果離體葉片再生能力極強的這一特點，使其有可能成為蘋果遺傳轉化的模式品種，這方面的研究正在進行中。

3．2 寒富蘋果葉片對不同細胞分裂素的反應

本研究發現以TDZ為細胞分裂素進行再生時，寒富蘋果的離體葉片再生頻率不僅很高(100％)，而且外植體平均再生芽數遠遠高于以BA為細胞分裂素的處理，可見，TDZ的再生效果要優于BA，這與前人的研究結果是一致的。但是以TDZ為主要激素進行再生時，再生苗的玻璃化程度較高，所發的芽呈叢生狀，不利于成苗，將TDZ再生的芽轉入含BA的培養基中，芽的狀態就恢復正常，Ibrahim等采用TDZ和BA 2步法誘導玫瑰(Rosa hybrida)葉片再生不定芽取得了良好效果，這種方法是否能夠提高蘋果葉片再生芽的數量、降低玻璃化程度和提高成苗率還有待于進一步研究。

3．3 秋水仙素離體誘導蘋果四倍體的方法

本研究用秋水仙素通過3種方法對寒富蘋果的離體葉片進行了誘導，用0.4％的秋水仙素水溶液震蕩培養4 d的方法未獲得再生植株，這與前人的研究結果略有不同，陳緒中等和王長泉等分別以0.5％的秋水仙素溶液處理鄂柿1號和嘎拉蘋果的離體葉片4 d，均獲得了多倍體植株。本試驗可能是由于震蕩培養使葉片充分與秋水仙素接觸和處理時間過長，從而導致葉片受毒害過重而失去再生能力，也可能是材料本身對秋水仙素比較敏感。本研究中葉片在含有秋水仙素的液體或固體培養基中處理，均誘導出了四倍體，這與前人研究結果相似，只是質量濃度略有差異。由于秋水仙素只能影響正在分裂的細胞，對處于靜止狀態的細胞不起作用，而在培養基上培養的葉片更具有分裂活性，因而增加了成功的幾率。而在培養基中附加低質量濃度的秋水仙素進行長時間的誘導的方法，不僅操作簡便，不易污染，且經濟實惠，相對高質量濃度短時間浸泡處理更合適一些。

4 結論

寒富蘋果葉片具有極強的離體再生不定芽能力，且對細胞分裂素十分敏感，在附加低質量濃度BA的培養基上具有較高的不定芽再生頻率。采用附加低質量濃度秋水仙素的液體或固體再生培養基處理試管苗葉片是獲得寒富蘋果四倍體的一個有效途徑。