桃野生種和地方品種種質資源親緣關系的ＡＦＬＰ分析

摘要：利用AFLP技術對94份野生桃種質資源進行了DNA多態性分析，從64對E+2/M+3引物組合中篩選出9對引物用于擴增基因組DNA，共獲得清晰可辨的236個標記，其中多態性標記為141個，多態性檢出率為59.9％。UPGMA聚類結果顯示，在遺傳距離約為0.326 7時，普通桃、陜甘山桃、光核桃3個種被聚為一類，與這3個種相近的為新疆桃，其次為甘肅桃，最遠為山桃(白花山桃、紅花山桃)。在遺傳距離0.217 8處，五月鮮扁干、白黏胡桃和琿春桃3份材料各自聚為一類。在遺傳距離約0.199 7處，普通桃又可明顯分為4個組：組Ⅰ包括原產于南方和西北地區的地方品種，且大部分南方蟠桃主要聚在此類；組Ⅱ僅有油桃(甘肅酒泉)一個野生材料；組Ⅲ包括野生毛桃和大部分原產于北方的地方品種，北方硬肉桃主要聚在這一類；組IV由白碧桃和白花山碧桃2個觀賞桃品種組成。

關鍵詞：野生桃；種質資源；親緣關系；AFLP

中圖分類號：S662.1 文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-305-07

桃[Prunus persica L.)Batsch]起源于我國西部地區，具有極其豐富的野生資源，經過長期自然選擇和人工馴化栽培，已經形成眾多的品種和類型。對于桃種質資源親緣關系的研究以往主要集中在形態學、細胞學、孢粉學、生物化學等方面。近年來，在DNA分子標記方面也進行了一些研究，但利用AFLP技術對野生桃種質資源系統進化和親緣關系的研究還未見報道。我們利用AFLP技術對94份桃野生和半野生種質資源進行了DNA多態性檢測，旨在澄清野生桃種質資源的親緣關系，為探討桃起源、進化、分類、育種和資源利用提供更多分子水平上的依據。

1 材料和方法

供試材料主要取自北京市農林科學院林業果樹研究所國家桃種質資源圃(表1中未作標記部分)，其中15份取自中國農業科學院鄭州果樹研究所(表1中帶“*”號標記)，2份取自江蘇省農業科學院園藝所(表1中帶“#”號標記)，采用改進的CTAB法提取基因組總DNA。

AFLP標記的PCR反應程序，模板DNA的限制性酶切和接頭連接，按照Life technologies公司的AFLP核心試劑盒(Cat.No.：10482-016)產品說明書進行：預擴增反應、選擇性擴增、PAGE電泳及銀染檢測參考吳俊等提供的方法來操作。對獲得的DNA譜帶進行數字化統計，有帶的計為1，無帶的計為0，將統計結果輸入計算機，并用NTSYSpc2.1和MEGA3.1 2種軟件結合進行聚類分析，即利用NTSYSpc 2.1軟件在Simint程序下選擇PSHAPE方法計算樣品間的遺傳距離，用MEGA 3.1(MolecularEvolutionary Genetics Analysis)軟件中的UPGMA法(Unweighted Pair Group Method Average)生成樹狀圖。

2 結果與分析

2．1 DNA質量檢測及AFLP擴增結果

采用改進的CTAB法對野生桃幼葉和成熟葉片的基因組總DNA進行了提取，均獲得了較高質量的DNA，通過AFLP指紋圖譜分析，帶紋清晰，完全滿足本實驗的要求。

本實驗從64對E+2/M+3 AFLP引物組合中篩選出9對引物用于擴增基因組DNA，共獲得清晰可辨的236條帶，多態帶為141條，多態性檢出率為59.9％。不同引物組合擴增效果差別很大，產生總帶數最多的組合是E-TI-/M-CTT，最少的是M-TG/M-CTT；多態帶最多的是E-TY/M-CTC和E-TT-/M-CTT，為22條，最少的為M-TG/M-CTT，僅有8條；E-TT/M-CTC多態性檢出率最高，達到75.9％，多態帶和總帶數最多的是E-TT-/M-CTI，但其多態性檢出率最低，僅為46.8％(表2)。

在聚類圖(圖1)中可以看出，在遺傳距離約為0.3267時，普通桃[P.persica(L.)Batsch]、陜甘山桃(P.davidiana vat.potaninii Rehd.)、光核桃(P.miraKoehne)3個種被聚為一類，與這3個種相近的為新疆桃(P.persica ssp.ferganensis Kost.et Riab.)，其次為甘肅桃(P.kansuensis Rehd，)，最遠為山桃[P.da-vidiana(Carr.)Franch.1。在遺傳距離0.217 8處，五月鮮扁干、白黏胡桃和琿春桃3份材料各自聚為一類。在遺傳距離約0.199 7處，普通桃又可明顯分為4個組：組Ⅰ包括原產于南方和西北地區的地方品種。共48個材料，且大部分南方蟠桃主要聚在此組。在遺傳距離約0.190 4處，這一類群還可分為個2亞組：大部分原產于南方的地方品種和南方蟠桃等38份材料聚到一起(亞組Ⅰ)，說明南方蟠桃和南方的地方品種有較近的親緣關系；大部分原產于陜西和甘肅等西北地區的地方品種構成亞組Ⅱ，包含龍246、鷹嘴、西教2號、下廟1號、巫山毛桃、中州白桃、早黃金、西莊1號、臨白4號、張白8號10份材料，其中有鷹嘴、中州白桃、早黃金3份材料特殊(鷹嘴原產于安徽。中州白桃原產于河南，早黃金原產于遼寧)。組Ⅱ只包含油桃(甘肅酒泉)一個野生材料。組Ⅲ包括野生毛桃和大部分原產于北方的地方品種，共33個材料。且北方硬肉桃主要聚在這一組。在遺傳距離0.190 4處，這一類可分為2個亞組：亞組Ⅰ為野生毛桃類。包括四川冕寧1號、四川冕寧2號、泰國安康、河北懷來、新疆1、新疆2、江蘇和湖北宜昌8個材料，這一亞組全部是野生毛桃，生長于野生地段，引種后以地名命名。亞組Ⅱ主要是原產于北方的地方品種。共25個品種，北方硬肉桃主要集中在此組。說明北方硬肉桃和野生毛桃類親緣關系較近。組Ⅳ由白碧桃和白花山碧桃2個觀賞桃品種組成，也說明了2者具有較近的親緣關系。

2．3 普通桃[P.persica(L.)Batsch]組間的演化分析

普通桃組間的演化先后順序為：組Ⅳ>組Ⅲ>組Ⅱ>組Ⅰ，可見北方地方品種(組Ⅲ)較南方地方品種(組Ⅰ)原始，南方品種較進化，這與桃品種孢粉學分析認為桃由北向南傳播的結果一致；野生毛桃類和北方硬肉桃親緣關系聚在一起(組Ⅲ)，說明2者親緣關系較近，也進一步證明北方硬肉桃原始性較強，與桃品種的同工酶分析得出硬肉桃與野生毛桃譜型相似，推測2者在種群演化過程中存在密切聯系的結果雷同；從起源地上看，組Ⅲ包括云南、貴州、四川、甘肅、新疆、遼寧、江蘇、北京、河北等，幾乎包含了從西到東、從北到南的廣大地區，可能桃種質在很早的時候就已經開始通過自然或人為因素傳播了。以地域的界限來分析桃的進化是不恰當的；來源于陜西、甘肅等西北地區的地方品種主要聚在組Ⅰ，說明西北地區的桃并不都處于較原始的分類地位，這可能是人類活動的頻繁，許多地方品種經過人類自然選擇造成的：大多數原產于南方的蟠桃與南方地方品種混成一類(組Ⅰ中亞組Ⅰ)，北方蟠桃中的碧霞蟠桃與北方硬肉桃聚在一起(組Ⅲ中亞組Ⅱ)，而五月鮮扁干與2個新疆桃品種聚在一起，證實了蟠桃點突變、多起源的特點，與楊新國等對桃種質親緣關系的RAPD分析結果基本一致。

3 討論

3．1 新疆桃和陜甘山桃的分類地位

新疆桃歸屬普通桃一個亞種(變種)已得到孢粉學、細胞學、生物化學等幾方面的證據，但在分子證據間卻存在著分歧。即楊英軍等用RAPD技術對桃屬中常見的4個種(普通桃、新疆桃、山桃和甘肅桃)及部分品種、變種進行親緣關系分析，發現新疆桃被歸入普通桃中，因此認為其應是普通桃中的一個變種：但Quaaa等的RAPD分析卻認為新疆桃是與普通桃親緣關系相當近的一個種。本文AFLP分析結果顯示：新疆桃聚在普通桃的類群中，與新疆桃是普通桃中的一個近緣種結論吻合。汪祖華等把陜甘山桃作為一個種，由于陜甘山桃除果核較山桃大外，其它植物學性狀與山桃極為近似，因此俞德浚認為應是山桃的變種。本文聚類圖中陜甘山桃在遺傳距離0.217 8處。與其它幾個種處于平行位置，所以我們支持陜甘山桃是一個種的觀點。

3．2 關于白花山碧桃起源的探討

白花山碧桃是桃花品種中唯一具有香味的品種，是目前培育早花桃和香花桃的重要親本材料。張秀英等對白花山碧桃進行了花粉掃描電鏡觀察，發現白花山碧桃花粉敗育現象嚴重。其花粉外壁紋飾與白花山桃和單白桃花粉外壁紋飾很相似，因此認為該品種與白花山桃和單白桃親緣關系密切。可能是天然遠緣雜交種。張春英等用RAPD標記對30個桃花品種的親緣演化關系進行研究，結果表明白花山碧桃與白碧桃間親緣關系最近，并結合形態觀察：白花山碧桃具有白花山桃的樹皮光滑、枝條細、開花早等特征，且花形又酷似白碧桃。說明白花山碧桃與白碧桃和白花山桃關系密切，推測白花山碧桃可能是白碧桃與白花山桃的雜交種。AFLP標記的結果顯示，白花山碧桃和白碧桃聚在一組，且與白花山桃有共同的特征帶。因此我們支持張春英等的觀點。

3．3 野生桃特殊種質的聚類分析

很多學者對琿春桃的分類及起源問題進行了研究，但存在著分歧。顧模從琿春桃與山桃的核型、核紋、果形、葉形、枝干特點和抗寒力等方面進行了考察，都發現琿春桃同時具有山桃和普通桃2者的性狀特點。得出琿春桃是山桃和普通桃的自然雜交種。而另外一些學者則認為琿春桃是普通桃類型，不是山桃和普通桃的雜交種，如金英善等和張潞生等通過對琿春桃、普通桃、山桃的過氧化物酶(POD)同工酶進行比較分析，發現琿春桃與普通桃酶譜極其相似，且未見有山桃的特征酶帶。因此認為琿春桃不是普通桃與山桃的自然雜交種，而是普通桃類型。宗成文等用RAPD標記對桃品種種質資源親緣關系進行分析時發現，琿春桃和山桃2個樣品沒有共同的特征帶，且琿春桃和山桃的遺傳距離較大，提出琿春桃可能不是山桃的自然雜交后代，而是普通桃的一個變種的結論。本文聚類結果顯示，樹狀圖中琿春桃不是聚在普通桃的類群中而是與種處于平行的位置，可斷定不是普通桃類型或其一個變種：且分別與山桃和普通桃具有共同的特征帶，因此琿春桃可能是山桃和普通桃的雜交種。此外，關于白黏胡和五月鮮扁干這2個種質的起源和演化位置還未見相關報道，要明確其分類地位還有待進一步研究。

4 結論

利用AFLP技術對94份野生桃種質資源進行了DNA多態性分析。UPGMA聚類結果顯示，在遺傳距離約為0.326 7時，普通桃、陜甘山桃、光核桃3個種被聚為一類。與這3個種相近的為新疆桃，其次為甘肅桃，最遠為山桃(白花山桃、紅花山桃)。在遺傳距離0.217 8處，五月鮮扁干、白黏胡桃和琿春桃3份材料各自聚為一類。在遺傳距離約0.199 7處，普通桃又可明顯分為4個組：組Ⅰ包括原產于南方和西北地區的地方品種，且大部分南方蟠桃主要聚在此類；組Ⅱ僅有油桃(甘肅酒泉)一個野生材料；組Ⅲ包括野生毛桃和大部分原產于北方的地方品種，北方硬肉桃主要聚在這一類：組Ⅳ由白碧桃和白花山碧桃2個觀賞桃品種組成，2者具有較近的親緣關系。普通桃組間的演化先后順序為：組Ⅳ>組Ⅲ>組Ⅱ>組Ⅰ，表明北方地方品種較南方地方品種原始，且北方硬肉桃原始性較強，蟠桃具有點突變、多起源的特點。