用于無核葡萄選育的胚挽救技術(shù)研究

摘要：通過4a的連續(xù)試驗，觀察了無核葡萄果粒及胚珠發(fā)育變化，對胚挽救的多個影響因素包括品種、接種時間、培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，紅臉無核、底來特、黎明無核作母本的胚珠萌發(fā)率較高；各品種適宜的接種時間為無核白花后26 d，紅臉無核花后35 d，愛莫無核×火焰無核花后48 d，底來特×紅寶石無核花后56d；用Nitseh作基本培養(yǎng)基優(yōu)于B₅；添加BA 0.2 mg/L獲得的胚珠萌發(fā)率最高；常溫黑暗、固體培養(yǎng)有利于胚珠的發(fā)育。已定植結(jié)果的無核葡萄雜交胚挽救后代的無核比率平均為58.6％。將胚挽救技術(shù)用于無核葡萄育種是十分有效的。

關(guān)鍵詞：無核葡萄；胚珠發(fā)育；胚挽救

中圖分類號：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-316-06

無核性狀作為葡萄(Vitis vinifera L.)重要的商品性狀，是當(dāng)前葡萄育種的重要目標(biāo)之一。無核葡萄分為2種類型：一種是單性結(jié)實類型，另一類型是種子敗育型，又稱“偽單性結(jié)實”。絕大多數(shù)的無核品種屬于第2種類型。如我們常見的無核白、京早晶、無核紫等。由于以無核葡萄作母本將難以得到雜交后代，所以常規(guī)無核育種方法都是以有核品種作母本，無核品種只能作父本。但是這種組合方式后代的無核比率一般只有0～15％。應(yīng)用胚挽救技術(shù)，可用無核葡萄品種作母本，后代的無核比率大大提高。據(jù)報道。無核×無核的雜交后代中無核的比率可達(dá)到82％。采用胚挽救技術(shù)擴(kuò)大了親本選擇范圍，從而大大提高了育種效率。

我們從1996年起開始利用胚挽救技術(shù)選育無核葡萄。對其影響因素進(jìn)行摸索和研究，將獲得的雜交胚挽救苗移栽定植，對已結(jié)果的株系進(jìn)行了鑒定，以期對該技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料

試驗在新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果開發(fā)研究中心進(jìn)行。1996—1999年進(jìn)行雜交授粉、胚挽救接種、移栽定植，2003—2005年對陸續(xù)結(jié)果的胚挽救株系進(jìn)行果實鑒定。

1996年試驗品種有：長穗無核白(Changsui-wuhebai)、紅無籽露(Suhanina Rose)、底來特(De-light)3個品種(自然授粉)。

1997年試驗品種有：無核白(Thompson Seed-less)、火焰無核(Flame Seedless)、紅臉無核(BlushSeedless)3個品種(自然授粉)。

1998年試驗品種或組合有：無核白和紅臉無核2個品種(自然授粉)，底來特×火焰無核、波發(fā)爾(Madh pa fare)×火焰無核、森田尼無核(CentennialSeedless)×火焰無核3個雜交組合。

1999年試驗品種或組合有：無核白和紅臉無核2個品種(自然授粉)，無核白×紅寶石無核(RubySeedless)、紅無籽露×黎明無核(Dawn Seedless)、黎明無核×火焰無核、愛莫無核(Emerald Seedless)×火焰無核、底來特×紅寶石無核5個雜交組合。

1．2 方法

在1997年對無核白、火焰無核和紅臉無核在花后18 d開始間隔5-7 d，在長勢一致的10個果穗上隨機(jī)取50個果粒和50個胚珠，測定果粒質(zhì)量和胚珠鮮質(zhì)量，觀察其發(fā)育變化情況。

各品種在盛花或授粉后不同時期，摘取幼果，自來水沖洗后，用70％乙醇浸潤30 s后用無菌水沖洗1次，在超凈工作臺上用0.1％升汞浸泡5～6 min，無菌水漂洗3～4次。用鑷子和手術(shù)刀將無菌果粒剖開，取出胚珠。接種至胚珠發(fā)育培養(yǎng)基Nitsch+IAA 1.5mg/L+GA₃ 0.5 mg/L+LH 500 mg/L蔗糖50g/L上。

1999年，在花后26 d取無核白胚珠接種在基本培養(yǎng)基為Nitsch和B₅，附加IAA 1.5 mg/L+GA₃0.5mg/L+LH 500 mg/L的胚珠發(fā)育培養(yǎng)基上，比較不同基本培養(yǎng)基對胚珠萌發(fā)率的影響。

1999年在花后39 d取紅臉無核胚珠接種在Nitsch+IAA 1.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L+LH 500 mg/L上分別添加BA 0、0.2、0.5 mg/L的胚珠發(fā)育培養(yǎng)基上，比較添加BA對胚珠萌發(fā)率的影響。

待胚珠萌發(fā)后，接至1/2 MS+IBA 0.1 mg/L的成苗培養(yǎng)基上萌發(fā)成苗和繼代擴(kuò)繁。

胚珠發(fā)育培養(yǎng)使用50～150 mL三角瓶。每瓶接種10-20個胚珠；胚珠萌發(fā)后轉(zhuǎn)至100-200 mL三角瓶成苗培養(yǎng)基，每瓶1株，以后進(jìn)行繼代擴(kuò)繁。

1997年對無核白、火焰無核和紅臉無核3個品種在胚珠培養(yǎng)階段采用常溫光照、低溫黑暗(接種后立即放置在4℃黑暗環(huán)境30 d后再放置在常溫光照環(huán)境)、常溫黑暗(保持黑暗條件60 d后轉(zhuǎn)為光照環(huán)境)處理，固體和液體培養(yǎng)等培養(yǎng)方式進(jìn)行試驗，每處理接種3～5瓶，2個月后調(diào)查綠色胚數(shù)、褐化胚數(shù)和產(chǎn)生愈傷組織的胚珠數(shù)。

培養(yǎng)室條件為溫度25～30℃，相對濕度40％～50％，光照強(qiáng)度54μmol/(m²·s)，每日光照16 h。

對已成苗的雜交胚挽救苗進(jìn)行煉苗移栽和定植，2003年部分株系開始結(jié)果，2004年和2005年的8月對結(jié)果植株進(jìn)行了無核株率的調(diào)查。

2 結(jié)果與分析

2．1 無核葡萄果粒及胚珠發(fā)育變化

由圖1可以看出，無核葡萄果實的發(fā)育呈較平緩的雙“S”型，而胚珠的發(fā)育與果實的發(fā)育不同，開始時胚珠逐漸增大。增大到一定時期和發(fā)育程度時就開始停滯或變小，即敗育。不同品種的胚珠，其發(fā)育進(jìn)程和程度有一定差異。無核白胚珠在花后24 d(6月14日)胚珠質(zhì)量達(dá)到最大，以后胚珠狀態(tài)變化不大；火焰無核胚珠在花后33 d(6月24日)發(fā)育至22.2mg時開始停止增大，變癟，胚珠重逐漸減小；紅臉無核胚珠前期一直增大。增至花后38 d胚珠質(zhì)量開始略有降低，后又增加至花后58 d(7月19日)達(dá)到最大24.5 mg，以后持續(xù)退化。從圖1的3個無核品種的胚珠質(zhì)量變化曲線可以看到，它們都不是呈現(xiàn)典型的拋物線，而是在花后30 d至花后58 d有略微下降之后又緩慢上升的過程。我們在定期取樣過程中發(fā)現(xiàn)，無核品種在花后30 d左右開始大量胚珠發(fā)育停滯，造成胚珠質(zhì)量降低，而之后少數(shù)發(fā)育未停滯的胚珠繼續(xù)發(fā)育，出現(xiàn)胚珠質(zhì)量又緩慢增加，至花后58 d胚珠中的胚徹底敗育，同時珠被也逐漸失水木質(zhì)化。最終胚珠質(zhì)量持續(xù)走低。因此，對于不同品種，應(yīng)確定其不同敗育時期，在胚珠達(dá)到最高發(fā)育程度并在敗育前時取樣接種，才有望培養(yǎng)成苗。

2．2 不同品種(自然授粉)、組合胚挽救結(jié)果比較

4 a的胚挽救接種試驗表明(表1)，不同的品種(自然授粉)、組合的胚珠萌發(fā)情況具有一定的差異。

1996年進(jìn)行胚挽救試驗結(jié)果表明，在同樣培養(yǎng)條件下，底來特(自然授粉)的胚珠萌發(fā)率明顯高于其它2個品種。達(dá)到了0.94％。1997年的試驗結(jié)果表明。在同樣培養(yǎng)條件下，紅臉無核(自然授粉)的胚珠萌發(fā)率高于其它2個品種，達(dá)到了1.26％。1998年對2個品種的自然授粉胚珠和3個雜交組合胚珠進(jìn)行了培養(yǎng)，其中底來特×火焰無核胚珠萌發(fā)率最高。達(dá)到4.62％。在1999年，進(jìn)行了2個品種和5個雜交組合的胚珠培養(yǎng)，其中無核白×紅寶石無核、黎明無核×火焰無核、底來特×紅寶石無核3個組合雜交胚珠萌發(fā)率都在5％以上。

紅臉無核、底來特、黎明無核及以其作母本所作的雜交胚珠培養(yǎng)萌發(fā)率較高，可能是由于這些品種胚珠敗育較晚。種子痕跡較大，胚敗育前發(fā)育較為完全，因此進(jìn)行胚珠離體培養(yǎng)成苗容易成功。無核白、火焰無核、愛莫無核也能達(dá)到一定的胚珠萌發(fā)率，而紅無籽露、森田尼無核胚珠很早就開始敗育，胚珠培養(yǎng)都沒有成功，以其作母本進(jìn)行雜交，難以得到雜交后代。

從表1中可見，后繼年度相同品種的胚珠萌發(fā)率有所提高，是由于隨著實驗的進(jìn)行，實驗人員胚珠培養(yǎng)操作技術(shù)和培養(yǎng)條件不斷改進(jìn)的緣故。

2．3 不同接種時期對胚挽救結(jié)果的影響

從表1中可以看出，無核白在花后26 d接種的胚珠萌發(fā)率高于花后19 d的，紅臉無核在花后35 d接種的胚珠萌發(fā)率最高，愛莫無核×火焰無核在花后48 d接種的胚珠萌發(fā)率達(dá)到3.11％。高于其它時間的。底來特×紅寶石無核在花后56 d接種的胚珠萌發(fā)率最高。為17.39％。

以上結(jié)果表明，每個品種或組合在不同時期胚珠發(fā)育的程度具有一定的差異，選擇胚珠發(fā)育到較高程度而且發(fā)育程度高的胚珠所占比例較高的時期進(jìn)行培養(yǎng)，容易得到較高的胚珠萌發(fā)率。

2．4 不同培養(yǎng)基對胚挽救結(jié)果的影響

2．4．1 不同基本培養(yǎng)基對胚珠培養(yǎng)的影響 無核白自然授粉胚珠接種在添加相同附加物的不同基本培養(yǎng)基上，以Nitsch為基本培養(yǎng)基的胚珠萌發(fā)率為15.0％，大大高于以B₅為基本培養(yǎng)基的3.1％(表2)，說明用Nitsch培養(yǎng)基進(jìn)行無核白胚珠培養(yǎng)較為適宜。

2．4．2 添加不同質(zhì)量濃度BA對胚珠培養(yǎng)的影響從表3可以看出，添加BA對紅臉無核的胚珠發(fā)育是有促進(jìn)作用的，其中添加BA 0.2 mg/L獲得的胚珠萌發(fā)率最高，達(dá)到7.0％，而添加0.5 mg/L的胚珠萌發(fā)率為4.9％，都高于不加BA的。挽救技術(shù)進(jìn)行無核葡萄選育，獲得平均無核株系比率58.6％。另一方面，不同組合所獲得的無核后代株系比率是不同的，范圍為33.3％～100.0％，說明不同無核雜交組合的無核性狀遺傳表達(dá)具有一定的差異性。但是由于獲得的雜交后代較少，無核親本的選擇與雜交后代無核比率的關(guān)系還有待進(jìn)一步試驗。

3 討論

在常規(guī)雜交育種中，為了選育無核葡萄，得到具有萌發(fā)能力的雜交種子，只能采用無核品種做父本，以具有無核傾向的有核品種做母本進(jìn)行雜交。采用這種方法選育無核葡萄，后代出現(xiàn)無核單株的比率很低，嚴(yán)重地限制了無核葡萄雜交育種的進(jìn)展。應(yīng)用無核葡萄胚挽救技術(shù)，將無核品種的胚珠在胚敗育前接種在合適的培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)，最終得到雜交后代。使無核葡萄間的雜交成為可能，提高了后代的無核比率。我們初步獲得了平均58.6％的無核比率。不同雜交組合后代的無核株系比率從33.3％到100.0％。這可能說明不同雜交組合的無核性遺傳有差別，也可能是受獲得的雜交后代數(shù)量較少所影響，還有待于繼續(xù)試驗觀察。

無核葡萄胚挽救技術(shù)的效果受許多因素的影響。首先，不同無核品種胚珠的發(fā)育程度是胚挽救成功與否的首要限制因子。無核葡萄胚珠發(fā)育開始時逐漸增大，到一定發(fā)育程度時就開始敗育。不同品種胚珠發(fā)育進(jìn)程和程度是有一定差異的。這與張大棟等的觀察結(jié)果一致。無核白、火焰無核和紅臉無核3品種胚珠敗育的時間依次延遲，而敗育時胚珠質(zhì)量依次增大。在相同培養(yǎng)條件下。胚珠敗育較晚、種子痕跡較大的紅臉無核、底來特和黎明無核作母本的雜交胚珠培養(yǎng)易于成苗，而紅無籽露、森田尼無核等品種胚珠敗育較早、種子痕跡較小，則難以得到胚挽救后代。說明母本基因型是胚挽救成苗率的決定因素。這與Goldy等、Ponce等得出的結(jié)論類似。張利等認(rèn)為同一品種胚的發(fā)育和敗育是不同步的，但都有一個急劇的敗育期。選擇胚珠急劇敗育之前，同時胚珠充分發(fā)育的時期進(jìn)行培養(yǎng)，才有可能獲得較高的胚挽救成功率。每一個品種需要在不同時期進(jìn)行胚培養(yǎng)。本研究確定的一些品種的適宜接種時期還需進(jìn)一步驗證。再者，適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對無核葡萄胚挽救的成功同樣是非常重要的。對于基本培養(yǎng)基，本文的實驗結(jié)果和Spiegel-Roy等的相同，Nitsch培養(yǎng)基用于無核葡萄的胚挽救是較為適宜的。添加活性炭和0.2～0.5 mg/L的BA對無核葡萄的胚珠發(fā)育有促進(jìn)作用。對于無核葡萄胚挽救的培養(yǎng)條件。一些學(xué)者采用全程光照條件，而有些學(xué)者在胚珠培養(yǎng)階段采用液體培養(yǎng)基和暗培養(yǎng)。我們的試驗說明，常溫、黑暗比低溫、光照更有利于胚珠的發(fā)育，原因可能是常溫黑暗模擬了田間自然生長條件，黑暗條件更是降低了褐化，從而促進(jìn)了胚在離體胚珠中的發(fā)育。由于胚珠在液體培養(yǎng)基中長期浸泡導(dǎo)致缺氧，所以采用固體培養(yǎng)基效果優(yōu)于液體培養(yǎng)基。

目前。分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在葡萄育種中加以應(yīng)用，應(yīng)用分子標(biāo)記可以對雜種后代進(jìn)行早期鑒定，如王躍進(jìn)等對葡萄的無核性狀分子標(biāo)記進(jìn)行了研究，已利用18 bp的無核探針成功的對有核品種與無核品種雜交后代的果實有核與無核性狀進(jìn)行了檢測。下一步我們會將胚挽救技術(shù)與分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合。以加速無核葡萄的選育進(jìn)程。

4 結(jié)論

利用胚挽救技術(shù)可以提高無核葡萄雜交選育的效率。無核葡萄果實的發(fā)育為較平緩的雙“S”型生長發(fā)育形式，而胚珠的發(fā)育先是逐漸增大。到一定時期和發(fā)育程度時則開始敗育。不同品種的胚珠，其發(fā)育進(jìn)程和程度有一定差異。胚挽救效果的主要影響因素有品種基因型、接種時間、培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式等。胚珠敗育較晚。種子痕跡較大的品種如紅臉無核、底來特、黎明無核等進(jìn)行胚珠離體培養(yǎng)容易成苗。每個品種胚珠的最佳接種時期不同。無核白花后26 d，紅臉無核花后35 d，愛莫無核×火焰無核花后48 d，底來特×紅寶石無核花后56 d取樣接種的胚珠萌發(fā)率最高：用Nitsch培養(yǎng)基進(jìn)行無核白胚珠培養(yǎng)較為適宜。添加0.2 mg/L BA對紅臉無核的胚珠發(fā)育有促進(jìn)作用。常溫黑暗和固體的培養(yǎng)方式有利于無核白、火焰無核和紅臉無核胚珠的發(fā)育。定植成活的5個無核×無核雜交組合后代中，株系有29個已結(jié)果，其中無核株系共17個，獲得33.3％～100.0％無核后代比率，無核比率平均為58.6％，說明采用胚挽救技術(shù)是加速選育無核葡萄品種的一條有效途徑。