中國櫻桃泰山干櫻Ｓ－ＲＮａｓｅ基因的克隆及序列分析

摘要：以中國櫻桃品種泰山干櫻為試材，利用李屬植物C2、C5保守區(qū)引物，擴(kuò)增花柱，S-RNase基因，獲得4個(gè)S等位基因，測序結(jié)果表明序列大小分別為：1608、950、796、504bp。根據(jù)同源比較發(fā)現(xiàn)大小為796 bp的等位基因與基因庫中登錄的SI—RNase為同一基因，其它3個(gè)S-RNase基因?yàn)槭状螆?bào)道，依序列大小分別命名為S2(1608 bp，登陸號(hào)EF541168)、S4(950bp，登陸號(hào)EF541173)和S6(504 bp，登陸號(hào)EF541172)。序列分析表明S2-RNase在C3區(qū)存在終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提早終止；S4-RNase的C5區(qū)前有插入片斷；S6-RNclse在高變區(qū)比其它S等位基因少一個(gè)氨基酸殘基。氨基酸序列同源性比較分析表明，中國櫻桃S—RNase與櫻花、扁桃的相似性高。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中中國櫻桃的4個(gè)S-RNase基因的氨基酸序列和櫻花、扁桃、甜櫻桃、酸櫻桃等一起歸于李亞科。

關(guān)鍵詞：中國櫻桃；自交親和；S-RNase；序列；系統(tǒng)樹

中圖分類號(hào)：S662.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-9980(2008)03-332-06

薔薇科的多數(shù)果樹，如蘋果、梨、甜櫻桃等的絕大多數(shù)品種均表現(xiàn)為典型的配子體自交不親和性，這對(duì)于以收獲果實(shí)為目的的果樹來說，自花不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率低無疑是不利的，生產(chǎn)上常因授粉樹配置不當(dāng)、人工授粉不及時(shí)或花期遭遇不良?xì)夂蚨绊懤ハx傳粉造成減產(chǎn)。因此闡明果樹自交親和與不親和的分子機(jī)制、篩選和培育自交親和品種成為國內(nèi)外科學(xué)家的重要研究目標(biāo)。

在薔薇科果樹中。李屬植物因其S位點(diǎn)區(qū)域的物理距離小而成為GSI研究的模式植物，櫻桃更以其天然存在自交親和與不親和、二倍體與多倍體的完整系統(tǒng)而成為研究李屬植物自交親和與不親和性作用機(jī)制及關(guān)系演變的理想材料。目前，世界上普遍栽培的櫻桃有4個(gè)種，其中歐洲甜櫻桃以其味美、外形美觀等特點(diǎn)深受消費(fèi)者喜愛，是經(jīng)濟(jì)栽培的主要對(duì)象。因其表現(xiàn)為自交不親和成為自交不親和研究的重要材料，國內(nèi)外有關(guān)其基因型鑒定、花柱S-RNase基因克隆表達(dá)及遺傳特性、花粉SFB(S locus F-box)基因的克隆表達(dá)等研究均有報(bào)道；而同為栽培種的中國櫻桃，作為我國特有的果樹種質(zhì)資源，與歐洲甜櫻桃在自交親和性及不親和性上表現(xiàn)截然不同，為四倍體植株，表現(xiàn)自交親和性，但是在國際范圍內(nèi)，尚未見有關(guān)其自交親和性分子基礎(chǔ)的研究報(bào)道。因此，我們以中國櫻桃品種泰山干櫻為試材，開展花柱S-RNase基因的克隆和序列分析，研究結(jié)果對(duì)于深入了解其自交親和遺傳信息，進(jìn)一步探討自交親和的分子機(jī)理具有重要意義，同時(shí)也將為實(shí)現(xiàn)甜櫻桃的自交親和性品種選育提供參考。

1 材料和方法

1．1 材料

供試中國櫻桃品種泰山干櫻來自山東省果樹研究所，春季選取幼嫩葉片，于液氮中速凍，置20℃冰箱貯藏備用。

1．2 基因組DNA提取

基因組DNA提取采用改良CTAB法。

1．3 引物設(shè)計(jì)

采用已發(fā)表的櫻桃S-RNase基因的C2區(qū)和C5區(qū)設(shè)計(jì)的通用引物Pru-C2/Pru-C5。由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，序列分別為：Pru-C2：5’CTATGGCCAAGTAATFATrCAAACC 3’，Pru-C5：5’CAAAATACCACTFCATGTAACAAC 3’。

1．4 PCR擴(kuò)增及檢測

引物Pru-C2/Pru-C5 PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含10×PCRBuffer，MgCl₂2 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物各0.15 μmol/L，Taq酶1 U，模板50 ng。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；33個(gè)循環(huán)的94℃變性60 s，56℃退火45 s，72℃延伸1.5 min：最后72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1．5 S基因擴(kuò)增片段的克隆、測序

將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到PMD-19載體中，轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α大腸桿菌中進(jìn)行克隆。藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆，對(duì)菌液進(jìn)行PCR檢測，用1.5％的瓊脂糖電泳檢測產(chǎn)物，確定插入片斷為目的片段，提取質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)有限公司測序。

1．6 序列比較和系統(tǒng)樹的構(gòu)建

利用軟件DNAMAN對(duì)克隆的序列進(jìn)行同源性比較；并利用Mega3.1對(duì)25個(gè)薔薇科、茄科、玄參科的S-RNase序列做多重比較，以鄰位相連法(neigh-bor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1．7 自交親和性的授粉試驗(yàn)

于開花前1d或當(dāng)天采集花蕾，取出花藥。待其自然開裂，花粉散出后，收集花粉備用。對(duì)當(dāng)天即將開花的花蕾在散粉前去雄，同時(shí)疏去一些生長較弱的花蕾，進(jìn)行授粉套袋，每組合250朵花。授粉后72 h，隨機(jī)選取10朵花，從花柱基部切取花柱，用FAA固定，利用熒光顯微鏡觀察花粉原位萌發(fā)及花粉管生長情況，方法參照Kho等，并進(jìn)行顯微拍攝，每個(gè)處理重復(fù)10根花柱。套袋后1周去袋，1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)坐果率。

2 結(jié)果與分析

2．1 泰山干櫻S-RNase基因的特異PCR擴(kuò)增

用Pru-C2/Pru-C5引物對(duì)泰山干櫻的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖譜中可擴(kuò)增出4條特異片斷(圖1)，這與中國櫻桃為四倍體植株是相符合的，即存在4個(gè)S等位基因。擴(kuò)增片斷大小范圍在1 700~600 bp，為了便于對(duì)這4個(gè)目的條帶進(jìn)行進(jìn)一步的分析研究，我們將其分別命名為A、B、C、D(圖1)。

2．2 泰山干櫻S-RNase基因的同源性比較

為進(jìn)一步分析擴(kuò)增產(chǎn)物的序列特征，對(duì)目的片斷回收、克隆并測序。測序結(jié)果表明，特異片斷A、B、C、D的大小分別為：1 658、1 001、846、565 bp。將序列結(jié)果在NCBI上同源比較，發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因與李屬植物櫻花、扁桃、甜櫻桃的S-RNases同源性在77.25％～98.31％(表1)，具有較高的同源性，可確定擴(kuò)增片斷均為S-RNases的等位基因。其中片斷C與吳燕等(www.ncbi.nih.gov)在中國櫻桃平都長把紅中得到并登陸的S1-RNase同源性100％，2者應(yīng)為同一S等位基因。在本試驗(yàn)中由于設(shè)計(jì)引物位置的變化，擴(kuò)增片斷長出117 bp，因此我們將片段C命名為S1，為了進(jìn)一步增加S基因的遺傳信息，該序列信息也登錄在基因庫，登錄號(hào)為：EF541170。而A、B、D 3個(gè)擴(kuò)增片斷均為首次發(fā)現(xiàn)的S等位基因，依片斷大小分別命名為S2 RNase、S4-RNase、S6-RNase(S3，S5為本實(shí)驗(yàn)室登陸的其它品種的S-RNase基因)，在基因庫中的登錄號(hào)分別為：EF541168、EF541173、EF541172。比較中國櫻桃4個(gè)RNase基因之間的同源性在66.9％～74.6％，其中，S2與，S4的同源性最低，而S2與S6的同源性最高(表2)。

3 討論

3．1 雌蕊S-RNase基因的PCR擴(kuò)增及DNA序列分析

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)越來越多植物花柱S-RNase基因序列信息的掌握，等位基因特異性PCR擴(kuò)增的方法在鑒定薔薇科植物個(gè)體的，S-RNase基因中得到廣泛的應(yīng)用，并證實(shí)了其有效性。甜櫻桃作為自交不親和研究的重要材料成為目前李屬櫻亞屬植物中自交不親和分子機(jī)制了解最多的樹種，同時(shí)也是較早采用同源等位擴(kuò)增方法鑒定自交不親和基因的樹種。陳曉流等根據(jù)薔薇科S-RNase基因(S基因)高度保守區(qū)C2和RC4區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物PruC2和PruC4R，鑒定了11個(gè)甜櫻桃品種的自交不親和基因型。本試驗(yàn)利用Tao等根據(jù)甜櫻桃S-RNase基因的C2區(qū)和C5區(qū)設(shè)計(jì)合成的通用引物Pru-C2/Pru-C5，成功的擴(kuò)增了中國櫻桃的4個(gè)S等位基因，并且在瓊脂糖凝膠上表現(xiàn)長度多態(tài)性。這與中國櫻桃的四倍體特征是相符合的，即存在4個(gè)S等位基因。在Genbank上對(duì)所克隆的4個(gè)片斷進(jìn)行BLAST比較，表明其與薔薇科S-RNases具有較高的序列同源性，且具有薔薇科李屬植物S-RNases基因的基本結(jié)構(gòu)特征—保守區(qū)C2、C3、RC4以及高變區(qū)HV，以上分析證明了所克隆的基因的確為中國櫻桃的花柱S-RNases，同時(shí)也說明了四倍體中國櫻桃的花柱S-RNases基因仍然具有李屬二倍體植物S-RNases的基本結(jié)構(gòu)特征。通過基因組序列信息比較同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，中國櫻桃的花柱S—RNases基因存在變異，例如S2-RNase的點(diǎn)突變(從AAA變?yōu)門AA)。導(dǎo)致翻譯的提前終止。此外，還存在插入片斷及高變區(qū)氨基酸殘跡的缺失現(xiàn)象。這些信息對(duì)于進(jìn)一步研究4個(gè)花柱S-RNases基因在自交親和性反應(yīng)中的作用機(jī)制提供了重要的線索。已有研究表明花柱及花粉S基因的堿基突變、插入或缺失是導(dǎo)致其自交親和性的重要因素。Sonneveld等發(fā)現(xiàn)甜櫻桃的SFB3’的部分堿基缺失，SFB4’則在高變區(qū)內(nèi)缺失了4個(gè)bp，從而導(dǎo)致含有這2個(gè)基因之一的品種表現(xiàn)自交親和性。Tsukamotoet等發(fā)現(xiàn)酸櫻桃的$6m2-RNase缺失了1個(gè)bp，S13m－RNase缺失了23個(gè)bp，SFBl3’也缺失了1個(gè)bp，并認(rèn)為酸櫻桃品種中變異基因的累加是導(dǎo)致其自交親和性的原因。本研究中S-RNase基因位點(diǎn)的變化是否也會(huì)引起中國櫻桃S-RNase表達(dá)蛋白功能的變化，從而影響自交親和性，還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3．2 S-RNases基因相似性的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

通過對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹和S-RNase的相似性比較分析。結(jié)果表明同為栽培種的中國櫻桃S-RNases不是與甜櫻桃表現(xiàn)最高的相似系數(shù)，而是與櫻花和扁桃S-RNases關(guān)系密切。特別值得提出的是，中國櫻桃S1-RNase與櫻花S46-RNase的相似性高達(dá)98.31％：中國櫻桃S4-RNase和櫻花的S50在C5區(qū)上游都包含一段其它薔薇科李屬S-RNase所沒有的氨基酸序列。這似乎表明中國櫻桃與櫻花有著比較近的親緣關(guān)系。我們?cè)鴩L試?yán)脵鸦▽?duì)中國櫻桃進(jìn)行授粉，結(jié)果顯示授粉后具有較高的坐果率，似乎也說明2者具有很好的親和性。要弄清2者在花柱S-RNase的起源進(jìn)化上的確切關(guān)系，還需要進(jìn)一步研究探討。

從本研究構(gòu)建的系統(tǒng)樹中可以看出。所鑒定的4個(gè)中國櫻桃S-RNases與其它李屬S-RNases推導(dǎo)的氨基酸聚為一個(gè)群體，形成李亞科，但未形成種內(nèi)特異性亞群，而是與其它李屬S-RNases隨機(jī)分布在李亞科群中；而蘋果和梨S-RNase聚為一體，形成蘋果亞科，這與甜櫻桃、扁桃、李、梅等的S-RNase系統(tǒng)進(jìn)化研究結(jié)論相一致，這一研究結(jié)果更加支持了薔薇科的S-RNase基因形成于亞科形成之后種形成之前的假說。

4 結(jié)論

利用S-RNase基因等位PCR擴(kuò)增技術(shù)成功地揭示了泰山干櫻4個(gè)S等位基因的長度多態(tài)性，并進(jìn)一步獲得核苷酸序列信息，同源比較確定其中的3個(gè)S等位基因?yàn)槭状伟l(fā)現(xiàn)的新基因，根據(jù)Genbank中的登陸號(hào)，泰山干櫻的基因型組成確定為SA1S2S4S6。研究結(jié)果為豐富薔薇科植物S-RNases遺傳信息，深入探討S-RNase的系統(tǒng)演化關(guān)系以及自交親和性分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。